4-C4基因在褐飞虱中的原位杂交分析.doc

4-C4基因在褐飞虱中的原位杂交分析4-C4基因在褐飞虱中的原位杂交分析陈智龙广州大学生命科学学院摘要 本研究以筛选褐飞虱唾液腺抑制差减杂交文库得到的差异表达明显的基因4-C4为研究对象，通过体外扩增、制备探针、褐飞虱石蜡包埋、切片，杂交、免疫反应、显色反应等方法对基因4-C4进行了RNA原位杂交分析，结果表明，此基因主要在褐飞虱的唾液腺部位表达，本研究结果为进一步分析基因4-C4的功能奠定了基础。关键词 褐飞虱 石蜡切片 探针 杂交 The analysis of in-situ hybridization of 4-C4 genes in the brown plant hopperChen ZhilongSchool of Life Sciences，Guangzhou UniversityABSTRACT In this study gene4-C4was used as probe to locate its expression inbrownplanthopper (BPH) tissues, which is screened from suppres- -sionsubtractivehybridization libraryof BPH salivary gland. By invitro amplification of gene 4-C4, preparationofprobes, embedding BPH by paraffin, hybridization,immune response,dyeing and so on. Our result showed that gene 4-C4 is mainly expressed inthesalivary glandsofthebrownplanthopper. The result in our research would lay the foundationforfurtherfunctionalanalysis ofgene4-C4.KEY WORDS Brown planthopper ; Paraffin section ; Probe ; hybridization；目录1 前言 12 材料与方法22.1 实验材料22.2实验试剂的配制22.3 实验步骤 42.3.1 制作褐飞虱石蜡切片2.3.1.1 抽气42.3.1.2 脱水52.3.1.3 浸蜡52.3.1.4 包埋52.3.1.5 切片52.3.2 杂交之前的准备工作52.3.2.1 4-C4基因的体外扩增52.3.2.1.1 制备感受态细胞52.3.2.1.2 转化62.3.2.1.3 提取质粒62.3.2.2 酶切 62.3.2.3 纯化酶切产物 72.3.2.4 制备地高辛标记的探针 72.3.3 原位杂交 82.3.3.1 预杂交82.3.3.2 杂交 82.3.3.3 杂交后处理 82.3.3.4 免疫反应 82.3.3.5 显色反应 92.3.36 封片观察 93 结果与分析 93.1 体外扩增提取质粒后电泳 93.2 酶切后电泳 103.3 酶切后再纯化质粒电泳 103.4 原位杂交后结果分析 114讨论12参考文献13致谢13 IV 1 前 言水稻是现在世界上的其中一种最主要的粮食作物，以水稻为主食的人口占世界上人口的一半以上1。而同翅目飞虱科昆虫褐飞虱通过吸食韧皮部的光合产物而直接危害水稻，除此之外还会传播水稻病毒造成间接危害，是对水稻危害最大的害虫之一，而它的迁飞习性使得对褐飞虱的检测和控制比较困难。如果用农药治害则会污染环境，而且久而久之还会在害虫身上产生抗体，对农药免疫。让水稻自身带上抗虫基因无疑是一个不错的方法，所以要研究水稻与褐飞虱之间的关系，了解褐飞虱对抗虫水稻的免疫原理，从而改良抗虫水稻，加强其抗虫功能。对提高水稻的产量是非常有帮助的。将提高水稻本身的抗虫能力与化学防治相结合，能在很大程度上防治褐飞虱的危害，是防治褐飞虱的重要策略的其中之一。只因目前推广培育的新品种水稻其所携带较单一或太弱或太少的抗性位点，经过大面积的种植之后，由于品种抗性胁迫，褐飞虱的致害性迅速地发生了变化，在2-3年内演化出新的生物型，导致水稻品种丧失抗性，尽管褐飞虱如何适应水稻品种并产生新的生物型的分子生物学机理仍有待研究，但是研究出携带强抗性的水稻品种的迫切性已经成为世界水稻抗虫问题研究的重要现状。所以研究褐飞虱与抗虫水稻的关系是研究生产高抗水稻的重要途径。我们的指导老师王小兰老师通过构建褐飞虱唾液腺的抑制差减杂交文库，然后得到了37个表达特异的基因，而4-C4基因就是其中一个，由于表达量明显而选择进行原位杂交分析。原位杂交是本次实验中用到的最主要的试验方法，原位杂交技术在生物学领域拥有十分广阔的应用前景，在我国生物科学、农业科学等方面都有着快速的发展。Pardue、Gall和John等学者于1969年首先创建原位杂交技术。该技术在许多研究中得以不断发展是因为许多关键性环节如重组DNA技术、染色体显带技术的更新与不断完善，特别是探针标记方法的改进。截止至目前，杂交分辨率已达到106-107bp2。原位杂交技术用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射自显影体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位以及相对定量研究的一种手段，通常分为两大类，即RNA原位杂交以及染色体原位杂交3。我们主要用到的是RNA原位杂交，是用放射性或非放射性（如地高辛等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，如果细胞中有与该探针互补的mRNA分子，则两者可杂交产生双链RNA，我们就能通过检测放射性标记或者酶促免疫反应显色，对这个基因的表达产物在细胞水平上做出定量定性的分析。这也是我们这次试验的主要手段4。手段、液腺本研究以筛选褐飞虱唾液腺抑制差减杂交文库得到的差异表达明显的基因4-C4为研究对象，通过体外扩增、制备探针、褐飞虱石蜡包埋、切片，杂交、免疫反应、显色反应5等方法对基因4-C4进行了RNA原位杂交分析.2 材料与方法2.1 实验材料褐飞虱若干只，抽气筒，4%多聚甲醛，烧瓶若干，切片刀，优质石蜡，玻片若干，电热炉，切片机，PBS缓冲液，DEPC水，大肠杆菌，CaCl2 ，含Amp固体培养基 ，溶液，溶液，溶液，氯仿/异戊醇，SCaI酶，电泳所需材料，无水乙醇，各种浓度乙醇，二甲苯，1%牛血清蛋白（BSA），SSPE，Tris-HCl，甲酰胺，DTT，50葡聚硫酸脂，10x盐，酵母RNA，SSC，TritonX-100，封阻液，抗体稀释液，缓冲液I，缓冲液，缓冲液，中性树脂，玻片，显微镜等2.2实验试剂的配制溶液：1M Tris(pH8.0)15mL,0.5M EDTA(pH8.0)10m 葡萄糖4.730g，加DEPC水至500mL，灭菌15min，存于4。溶液：2N NaOH 1mL,10%SDS 1mL,加DEPC水至10mL。溶液：5M 醋酸钾（KAc） 300mL，冰醋酸57.5mL，加DEPC水至500mL。（1） 0.2mol/LHCl（共1L）表1 0.2mol/LHCl配制浓HClDEPC-H2O17mL 9983mL（2） 2 x SSPE：用SSPE母液稀释； （3）含1牛血清蛋白（BSA）的0.01mol/LTris-HCl（PH8.0）：表2 含1牛血清蛋白（BSA）的0.01mol/LTris-HCl（PH8.0）配制BSA10mM Tris-HCl（PH8.0）1g99mL（4）探针稀释液的配制表3 探针稀释液的配制50甲酰胺1mDTTDEPC水100l 2 l 198l（5）杂交缓冲液的配制 表4 杂交缓冲液的配制10x盐甲酰胺50葡聚硫酸脂酵母RNA25mm/LDTTDEPC水125l500l250l4l2.5l（100mM）定容至1mL（6）封阻液的配制表5 封阻液的配制 牛血清蛋白（BSA）TritonX-100缓冲液I0.06g9l补足至3mL（7）抗体稀释液配制：表6抗体稀释液配制牛血清蛋白（BSA）TritonX-1001 x PBS缓冲液0.01g1.5l 补足至1mL（8）稀释的anti-DIG-AP的配制（1：500比例）：表7 稀释的anti-DIG-AP的配制Anti-DIG-AP抗体稀释液2l 1mL2.3 实验步骤2.3.1.制作褐飞虱石蜡切片2.3.1.1 抽气：（1）先将捉到的若干褐飞虱浸入4%多聚甲醛中，过夜；（2）将过夜后的褐飞虱连同多聚甲醛放入抽气筒来回抽气，直到所有褐飞虱都沉到液体底部；（3）再将抽气后的褐飞虱置于烧杯中，用PBS洗3次，每次10min。2.3.1.2 脱水：叔丁醇7步脱水，每级4-12h表8 叔丁醇7步脱水浓度级别123456795%乙醇（mL）121515127.500DEPC-H2O（mL）1594.51.5000100%叔丁醇（mL）3610.516.522.530302.3.1.3 浸蜡：经过了最后一级脱水之后将材料转入新的100%叔丁醇中在58-60的烘箱中渐渐加入石蜡开始浸蜡。大约3-4h加入石蜡一次，一开始的时候加入的量少一些，大约是叔丁醇体积的5%-10%。2.3.1.4 包埋：将浸蜡一天后的材料转入100%石蜡中包埋。先将固体石蜡用电炉溶于一个烧杯中，然后将其倒入预先折好的纸盒中，再把浸好蜡的褐飞虱倒入纸盒中，迅速将褐飞虱个体一个一个分开，每个个体之间都要有一定的间隔，待石蜡凝固，将其常温保存。2.3.1.5 切片：将包埋后的石蜡中的褐飞虱个体取一个切下来，修成长方体，注意尽量让个体在石蜡中间，然后便可以固定于小木块上切片，切成连续带状，并将切出来的一条一条的带状石蜡置于预先用鸡蛋清涂抹过的玻片上（一个虫切两张片，一张SP6，一张T7，并将条带状石蜡交替置于这两张玻片中，好作对照）。 2.3.2 杂交之前的准备工作2.3.2.1 4-C4基因的体外扩增2.3.2.1.1 制备感受态细胞：（1）2%接菌量；（2）2h后，取出，冰浴30min；（3）超净工作台中配平， 4000rpm，4，5min离心菌体，弃液；（4）冰浴的CaCl2悬浮菌体，合并成一管， 3000rpm，4，5min；（5）CaCl2再次悬浮菌体，冰浴20min， 3000rpm，4，5min；（6）CaCl28mL悬浮菌体，分装与EP管中，-80保存（加一些甘油覆盖住表层）。2.3.2.1.2 转化：（1）取1l带有4-C4基因的原始质粒（已经过前人处理，连接有Amp抗性基因） ；（2）加入150l感受态细胞；（3）冰浴30min；（4）42热击90s；（5）冰浴5min；（6）将感受态细胞涂布于加有Amp的培养基中，18h培养。2.3.2.1.3 提取质粒：挑取单克隆，每种质粒挑两个单克隆，每个单克隆提两管质粒。（1）8000rpm，1min离心菌体，弃液，再重复一次；（2）100l冰浴的溶液，悬浮；（3）200l溶液，温和混匀，静置3min；（4）150l冰浴的溶液，迅速混匀，剧烈，加入150l DEPC水；（5）加入等体积氯仿/异戊醇，震荡，4， 12000rpm， 10min；（6）移上清于另一干净的EP管中，加入两倍体积乙醇，混匀，室温15min，4，12000rpm，10min；（7）70%乙醇洗沉淀，4，8000rpm，1min，弃上清，晾干沉淀；（8）溶于DEPC水中，加入30l RNAase，37，水浴消化RNA。2.3.2.2 酶切：根据下表所列步骤进行酶切表9 酶切步骤质粒SCaIbufferH2OTotal6l1.5l5l31.5l50l电泳，37，过夜。 2.3.2.3 纯化酶切后产物：（1）将酶切产物用DEPC水补足至100l，加入100l氯仿/异戊醇（24:1）；（2）12000rpm，4，5min；（3）取上清层，然后加两倍体积的无水乙醇，沉淀20min；（4）12000rpm，4，10min，弃液；（5）70%乙醇洗涤一次，12000rpm，1min；（6）室温晾干，保存于-20。2.3.2.4 制备地高辛标记后的探针：将2mLEP管标记好置于冰上，按以下表格步骤制备探针：表10 制备探针步骤线性化质粒NTP（DIG-MIX）5bufferRNasesinDEPC水SP6 RNA聚合酶T7 RNA聚合酶2l2l4l0.5l18l2l2l2l4l0.5l18l2l轻轻摇匀，37中2h；再加入2l无RNase的DNaseI，37，15min，然后加入1l 0.5M的EDTA终止反应，最后加入1.3l 8M的Licl，75l预冷的无水乙醇，-20过夜沉淀。取出过夜沉淀的探针，12000rpm，4，5min，弃上清，加入70%乙醇（冰浴），12000rpm，4，5min，弃上清，晾干后溶于45l DEPC水中，保存于-20。2.3.3 原位杂交2.3.3.1 预杂交：（1）将干燥的石蜡切片在二甲苯中脱蜡30min（2）在 二甲苯：乙醇（1:1）、100乙醇、95乙醇、70乙醇、30乙醇、DEPC-H2O中复水，每级2min。（3）在0.2mol/L HCl中处理20min（3）在2 x SSPE中洗两次，DEPC-H2O中再洗两次，每次5min（5）在含1牛血清蛋白（BSA）的0.01mol/LTris-HCl（PH8.0）中浸10min（6）DEPC-H2O中洗两次，每次5min（7）在30乙醇、70乙醇、95乙醇、100乙醇中系列脱水，2min/次（8）将所有玻片最后置于干净染缸中晾干。2.3.3.2 杂交：取出4个EP管，分别标记好，准备好探针稀释液，杂交缓冲液，处理的SP6探针和处理的T7探针。（1） 将探针用稀释液稀释，即2.5l x 2探针加入97.5l稀释液中；（2） 70加热5min，再加入400l x 8杂交缓冲液；（3） 将玻片置于湿盒中，每块玻片上滴加杂交液100l，轻轻盖上180烘 烤12h的盖玻片（注意不要产生气泡，盖玻片在工作台上的架子上，用烧杯装着）；（4） 最后置于60烘箱中保温过夜（一般16-18个小时左右）；2.3.3.3 杂交后处理：（1） 从60烘箱中取出湿盒，将玻片移入2 x SSC中让其自由滑落（大概15min） （2） 转入另一2 x SSC中浸泡15min（3） 再转入1 x SSC中浸泡15min（4） 最后转入0.5 x SSC中浸泡10min2.3.3.4 免疫反应：（1）经SSC浸泡后的的玻片移到缓冲液I中浸泡5min（2） 再将玻片移到湿盒中，每个玻片上滴加375l封阻液，盖上湿盒盖，室温30min。（3）倒掉封阻液，每片加稀释的anti-DIG-AP 125l，湿盒室温2-4h。 2.3.3.5 显色反应：（1）将玻片转到缓冲液I中5min，再将玻片转到另一缓冲液I中浸泡5min（2）将玻片移入缓冲液II中浸泡5min（3）将玻片移到湿盒，每片加100l显色液，用处理的盖玻片盖片，最后盖上湿盒盖子，将湿盒移到没有光线的地方暗显色6-12h2.3.3.6 封片观察：（1）将玻片移到缓冲液III中浸泡5min，终止反应（2）再移到另一缓冲液III浸泡5min（3）分别将玻片置于30、70、95、100乙醇、二甲苯：乙醇（1:1）、二甲苯中，2min/次。（4）将玻片置于干净手套，等二甲苯稍微晾干一点点的时候用1mL移液枪吸取中性树脂，让其自由滴落在虫子组织中心部位，最后用处理的盖玻片封片(注意不能有气泡)（5）在10倍显微镜下观察是否有杂交显色，如果发现，做好标记。3 结果与分析3.1 体外扩增提取质粒后电泳 图1 提取质粒电泳图如图，我们一起提的质粒的电泳图，4-C4基因是泳道7和8,M是marker，从图中可以看出，我们提的质粒的浓度还是比较浓的，因为亮度很亮，而且没什么杂带，所以算是提取得比较成功的。3.2 酶切后电泳图2 酶切后电泳图如图，1泳道是4-C4基因酶切后电泳图，2泳道是4-C4基因提取得质粒的电泳图，从图中可以看出，酶切后大部分质粒已线性化，所以只有一条亮带，而2泳道质粒则是有一条粗带，还很杂。所以酶切很成功。3.3 酶切后再纯化质粒电泳图3 纯化后电泳图如图，M是marker，7泳道是纯化后的酶切质粒，对比上图未纯化酶切质粒，纯化后的质粒线条更细，说明纯化效果好，可用来制作探针了。3.4 原位杂交后结果分析图4 4-C4基因在褐飞虱组织中的原位杂交 如图，左边是SP6探针的原位杂交图片，右边是T7探针的原位杂交图片，显然两张图片是褐飞虱的同一组织部位，染色较深的部位是唾液腺。由图可看出，本次试验已成功地将4-C4基因与褐飞虱组织杂交，右边的是有杂交信号的，而左边的则没有杂交信号，形成了明显的对比。由于4-C4是未知基因，在blast中找不到同源序列，其作用还不甚清楚，通过这个实验，我们已经知道了4-C4基因主要在褐飞虱的唾液腺表达，可能是与褐飞虱取食水稻时与水稻互作的激发子有关，所以本次试验为探究4-C4基因在褐飞虱中的作用以及与抗虫水稻的关系打下了基础。4讨论这次试验最关键的步骤并不是在杂交那几步，而是前面的准备工作，因为如果准备工作做不好，杂交就肯定会失败。比如说第一，制作褐飞虱石蜡切片6，这一步非常讲究操作切片机的技术，切片的时候摇切片机手柄的速度要均衡，不然很容易断片，一旦断片就很难继续切下去，还有必须时刻检查刀片的磨损程度，一旦变钝，就要拿到厂商那里请专业人士磨刀，还要记好切好的带状石蜡切片应该摆到哪个已标记好的玻片上。第二，制备探针7，如果制备的探针浓度太高，则会产生非特异性杂交，使杂交后整块组织都染上色，如果浓度太低，则杂交后的对比不明显，所以控制好探针的浓度是关键。经过了好几次的摸索和失败，我们终于找到了最适合的探针浓度。第三，必须全程防止RNase的污染，一旦有RNase的污染，则探针就会被降解8 ，我们前面的工作就全部白费了，所以在试验中，我们是全程都戴着一次性手套的，而且我们的实验用的器材都必须用之前拿到烘箱里200烘烤18小时，以消灭RNA酶。第四，石蜡切片最后是要放到载玻片上的，之后脱蜡步骤很容易会把切片中的虫子一起脱掉，所以载玻片的处理是非常重要的，我们是在石蜡切片放到载玻片上之前，先用鸡蛋清涂满整张载玻片，这样就可以吸住褐飞虱组织片段，不至于在脱蜡时从玻片上脱落。除了以上四点之外，还有其它值得注意的地方，这里就不一一列