NG2与少突状胶质细胞.ppt

在EAE中 NG2与神经炎症 血脑屏障改变 OPCs反应及DCs激活有关 影响因子 12 213Accepted 15March2016 Moransard等人研究EAE在NG2KOmice的作用 发现与WTmice并没有发现任何差异而本作者采用通过样的方法 发现NG2在EAE中发挥着重要的作用 实验方法工具 1 ELISA 酶联免疫吸附试验2 EAE建模方法3 工具鼠4 bonemarrowchimeramouse5 血管内皮通透性试验 1 ELISA 酶联免疫吸附试验 OD 2 EAE建模方法 EAE模型是中枢神经系统内小血管周围出现单核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病 是人类多发性硬化 MS 的理想动物模型 雌鼠步骤 MOG35 55 200ug PBS水溶液100ul H37RA 结核分枝杆菌300ug 然后300ul不完全弗氏佐剂超声乳化 尾静脉一次每只0 1ml 百日咳病毒 原液400ng ul 用PBS稀释使用 每只老鼠腹腔注射0 1ml 第2天注射 皮下两侧尾静脉 利用同源重组技术WTC57Bl 6Jmice F1NG2 MiceF2NG2 Mice NG2 MiceWTMice纯合的NG2KOmice 3 工具鼠 theinsertionofa1100 bpneomycin resistance F1 WT 4 bonemarrowchimeramouse 骨髓嵌合体小鼠 淋巴造血系统嵌合体 放射性嵌合体 彻底破坏受者机体骨髓的造血系统 最大程度的杀灭肿瘤细胞 骨髓含造血干细胞 血液也有 白血病 同基因型 5 FITC dextran 血管内皮通透性试验脑微血管内皮细胞 BMEC 拥有丰富的酶系统 但缺乏收缩蛋白 故正常生理状态下组胺 5 羟色胺 白三烯C4等血管活性物质较少影响血脑屏障而病理状态下因BMEC酶系统活性改变 活性物质将影响BMEC 从而进一步影响血脑屏障的通透性 开放的血脑屏障能让大分子如右旋糖酐通过 在EAE中 NG2与神经炎症 血脑屏障改变 OPCs反应及DCs激活有关 Introduction 1 NG2 硫酸软骨素蛋白多糖 OPCs和激活的周细胞表达 NG2 PDGFR 是OPCs NG2cell 的marker 当其分化成少突状胶质细胞时 这两个marker不表达 CNS损伤时 OPCs反应性增殖 表达NG2的细胞在炎症部位聚集 EAEandMS 急性期 OPC的数量显著增加 在慢性后期中 显著减少 OPCs分化为少突状胶质细胞 促进髓鞘的生成 CNS微血管中 周细胞促进血管生成 促进紧密连接的形成 从而保护BBB通透性和维持内皮细胞屏障的功能 CNS损伤时 充当炎症传感器 免疫监视 执行中性粒细胞巨噬细胞的功能 2 表明NG2与CNS损伤的炎症息息相关胶质瘢痕 由于缺氧 低血糖 感染 中毒等均能引起脑组织的损伤而导致星形胶质细胞增生 反应性星形胶质细胞增生是脑组织损伤的修补反应 减弱星形胶质细胞增生 有利于改善脑缺血后神经功能恢复胶质瘢痕形成是一个极其复杂的病理生理过程 包括组织水肿 炎症反应 局部缺血 谷氨酸受体高反应性 脂质过氧化作用 钙离子超负荷 自由基损伤 反应性星形胶质细胞增生 EAEBBB渗透性改变的疾病3 NG2炎症浸润CNS损伤有关 4 NG2KOmice EAE的临床表现型更轻微Unexpectedly NG2有助于EAE的发病机制OPCs及周细胞表达NG2原因免疫细胞也表达NG2 Abstract 在成年人的CNS中 OPCs表达NG2在病理情况下 NG2是周细胞激活的markerEAEBBB渗透性改变的疾病NG2炎症浸润CNS损伤有关 1 在NG2KOmice中诱导EAE的发生 相比WT NG2KOmiceEAE临床评分更轻微 OPCs的数量在EAE诱导后无改变2 发现NG2在免疫细胞中表达 如T细胞 巨噬细胞树突状细胞3 评估了T细胞致脑炎性物质 WTNG2KOmice增殖的致脑炎物质MOG35 55水平相同 However NG2KOmiceT细胞反应偏向于Th2型反应4 是否分泌了炎性因子 联想到DCs 测定IL 12表达情况 NG2KOmice中 IL 12 expressingCD11c 细胞显著减少 更重要的是 在WTmice中 IL 12的表达在CD11c NG2 cell比CD11c NG2 cell要更少5 是否NG2与免疫系统和CNS水平有关 骨髓嵌合体老鼠 相比接受WT骨髓的mice 接受NG2KOmice骨髓的 EAE症状更轻微 研究思路 Results 1 NG2KOmice的EAE表现型更轻微2 NG2KOmice骨髓中 EAE相关的炎症更轻微3 EAEinducedNG2KOmice OPCs的数量无改变4 EAEinducedNG2KOmice 紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关5 免疫细胞表达NG26 NG2KOmice T细胞对MOG反应 炎症较少7 NG2KOmice IL 12表达较少 NG2参与DC的激活8 NG2不参与巨噬细胞的极化9 NG2KOmice 可调节的免疫反应 保守的BBB导致了EAE轻微的表现型 1 NG2KOmice的EAE表现型更轻微 Arepresentativeofthreeindependentexperimentsispresented 26 33 100 78 78 diseaseincidence 84 4 5vs 100 inWTmice Diseaseonsetwasdelayed 13 06 3 66vs 8 16 1 71daysforWTmice Arepresentativeofthreeindependentexperimentsispresented CD45 血管周浸润的炎性细胞 巨噬细胞CoIIIV microvesselbasallaminaTO PRO 3 细胞核 脊髓截面染色 小胶质细胞 巨噬细胞 激活的星形胶质细胞 Stressmarker positivecells 浸润的T细胞 大脑皮层 脊髓 2 NG2KOmice骨髓中 EAE相关的炎症更轻微 EAE相关的促炎性基因的mRNA的表达情况 3 EAEinducedNG2KOmice OPCs的数量无改变 EAEandMS 急性期 OPC的数量显著增加 在慢性后期中 显著减少 脱髓鞘过程中 WhetherNG2缺失影响少突状胶质细胞的免疫反应 首先要证明NG2是不存在的或不生成免疫荧光定量分析OPCs数量确定PDGFR 确定NG2的确敲除了 且在NG2KOmice中不表达 EAE theinsertionofa1100 bpneomycin resistance 在NG2KOmice中 NG2特异性的信号没有被发现 基于NG2敲除的前提下 理解为没有生成 实验更加严谨 IFN EAE 研究NG2缺失 免疫荧光定量分析OPCs数量 MBP 神经纤维APP 损伤的轴突 4 EAEinducedNG2KOmice 紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关 周细胞 神经血管形成BBB功能NG2KOmice中 是否神经炎症水平降低与血脑屏障特异性改变有关研究了内皮细胞的紧密连接蛋白 claudin 5 occludin 咬合蛋白 的结构和功能的分布血脑屏障结构和功能的改变与紧密连接蛋白的表达变化有关 Dextran FITCexperiments 血管内皮通透性试验 NG2KOmice周细胞缺乏NG2影响TJs的动态组合可替换信号转导途径 5 免疫细胞表达NG2 NG2KOmice 巨噬细胞产生更少的炎性物质 浸润能力减弱NG2可能与其他炎性细胞浸润CNS有关 whetherNG2isexpressedinWTmiceornotbycellsofthesystemicimmunesystem TCellBMDDCsBMDMs CD3 TCellCD11c BMDDsCD11b BMDMsDAPI 核酸 DNAAT区 6 NG2KOmice T细胞对MOG反应 炎症较少 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA positive 植物血凝素类多克隆刺激剂 通过细胞表面的CD3 TCR复合体作用于T细胞 对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖 加入anti CD28作用更强PLP negativeMO35 55 EAE 6 NG2KOmice T细胞对MOG反应 炎症较少 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA positive 植物血凝素类多克隆刺激剂 通过细胞表面的CD3 TCR复合体作用于T细胞 对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖 加入anti CD28作用更强PLP negativeMO35 55 EAE 6 NG2KOmice T细胞对MOG反应 炎症较少 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA positive 植物血凝素类多克隆刺激剂 通过细胞表面的CD3 TCR复合体作用于T细胞 对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖 加入anti CD28作用更强PLP negativeMO35 55 EAE 6 NG2KOmice T细胞对MOG反应 炎症较少 是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA positive 植物血凝素类多克隆刺激剂 通过细胞表面的CD3 TCR复合体作用于T细胞 对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖 加入anti CD28作用更强PLP negativeMO35 55 EAE 抑炎 促炎 T增值情况 ConA CD3 TCRConA NG2 NG2 DCs髓系DCs IL 12Th0Th1BMDDCs淋巴系DCs IL 4Th0Th2 7 NG2KOmice IL 12表达减少 NG2参与DC的激活 是否IL 12表达与NG2表达有关 IL 12