第八章 生物酶工程.doc

第八章 生物酶工程 近年来，酶学与其他学科交叉和渗透十分活跃，其研究领域得到了进一步扩展。 1873年发现第一个酶开始，经历了很长时间，在1936年得到结晶酶，才认识到酶是蛋白质。19811986年已经认识到有些酶是由核酸组成，酶催化的本质是RNA。例如核糖核酸酶，磷酸酶等第一节 核酶ribozyme原生动物四膜虫rRNA作用 加工成成熟的26S rRNA81年研究发现: 四膜虫rRNA前体有6400个核苷酸，其中有两个外显子和一个内含子，成熟过程是内含子切除，两个外显子连接成成熟的rRNA，这个过程称为剪接。 这个剪接过程不需要别的酶参与催化，不需要ATP等提供能源，靠5-GMP、Mg2+参与。这种 rRNA 前体自我的剪接功能的特性，排除了任何蛋白质的催化作用。但当时有争议：1）它只是自身催化，而不能催化其他分子反应。2）一般意义上的酶催化剂在反应前后应该没有变化。而在rRNA前体成为成熟的rRNA，切去内含子后，它不再有催化能力。如四膜虫前体rRNA在低浓度阳离子下，切去一个内含子，余下部分连成rRNA，这种自我剪切是靠自己前体rRNA。 rRNA自我剪接的前体加工功能与自身的结构有关。而且还发现高温、内含子互补的核苷酸序列、高浓度的变性剂等可以丧失其自我剪接的加工功能。进一步的研究发现，这种自我的剪接以后释放出来的内含子可以通过转磷酸酯反应自我环化。ribozyme的种类：大分子核酶：第类内含子、第类内含子、核糖核酸酶P的RNA亚基小分子核酶：锤头型、发夹型、HDV、VS核酶分子内反应：自我剪切（self-cleavage) 分子间反应：自我剪接(ribozyme)自我剪接ribozyme分类型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5鸟苷酸）和Mg2+参与。型IVS ：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成核酶是一种金属依赖酶金属离子的作用：n 1、特异的结构作用，或参与活性部位的化学过程n 2、促进RNA的总体折叠n 3、二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成核酶的作用：n 1、转核苷酸作用n 2、水解作用n 3、转磷酸作用n 4、去磷酸作用n 5、限制性内切酶作用影响核酶活性的因素1、pH值对活性的影响 pH7.0 - 7 .5 时核酶活性最高。2、二价金属阳离子对活性的影响 Mg 2+ Mn 2+ 3、抗生素对活性的影响 大多数为抑制效应4、变性剂对活性的影响 影响核酶的切割效率 5、温度对活性的影响 在65范围内随温度升高而增加，37 时均有适宜的活性。脱氧核酶 具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶。利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。所有脱氧核酶都是单链分子，能进行折叠、催化和展现酶活性。分类：具有RNA切割活性具有DNA连接酶活性具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性具有DNA水解活性具有DNA激酶活性具有N2糖基化酶活性具有DNA戴帽活性第二节 进化酶n 生物酶工程：是酶学和现代分子生物学相结合的一门新兴的生物工程。属于酶工程上游技术。n 研究内容：1.克隆酶：利用遗传工程技术，通过酶基因的高效表达提高酶的产量。2.进化酶：酶分子的合理设计和酶分子的非合理设计。3.新酶：从设计基因开始，合成自然界并不存在的新酶。克隆酶1、目的基因的获得2、选择载体3、重组体DNA的连接4、重组DNA的转化5、克隆酶基因的表达系统 原核生物的基因表达系统 真核生物的基因表达系统n 酶分子改造q 化学修饰，定点突变 n 定向进化n 突变酶研究的主要内容： 酶的选择性遗传修饰； 酶基因的定点突变；q 在分析氨基酸序列，弄清酶的一级结构以及空间结构的基础上，再在由功能推知结构或由结构推知功能的反复研究下，设计酶基因的改造方案，确定选择性遗传修饰的修饰位点。n 寡核苷酸引物诱变、n PCR诱变n 盒式诱变定向进化属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 随机突变+定向选择目标突变体定向进化技术： 易错PCR、DNA改组、随即引物体外重组、交错延伸澄清一个事实：定向进化不是定点突变n 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。n 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。定向进化的应用n 提高酶分子的催化活力n 提高酶分子的稳定性n 提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化n 对映体选择性的定向进化n 变换催化反应专一性新酶蛋白质分子设计n 根据生物体内已有酶的功能和性质，分离纯化这种酶，并确定其氨基酸序列，进而推知该酶基因序列。再根据设计的需要，对酶的基因进行改造，从而获得符合我们需要的酶。n 从头设计酶，对酶空间结构框架，催化活性，底物结合，底物专一性等进行合理的设计。第三节 杂合酶杂合酶：由两种以上的酶成分或酶构成的新酶。即把来自不同酶的结构单元（单个功能基、二级结构、三级结构或功能域），或整个酶分子，进行组合或交换，可能获得所需性质的优化酶杂合体。研究