膜片钳技术在心律失常研究中的应用 动物生理学.doc

膜片钳技术在室性心律失常研究方面的功能生命科学学院2011级 2011012911 姜悦摘要：心律失常研究的复杂性,与心脏分布着众多离子通道密切有关。应用膜片钳技术可以直接记录细胞膜离子通道的活动,研究“开”、“闭”动力学,离子通透性及选择性等,并且采用先进的计算机技术对离子通道活动的记录进行分析。在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响心肌生理功能的机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域。本文将就膜片钳技术在室性心律失常研究方面的功能加以阐述。关键词：膜片钳 心肌电生理 室性心律失常 离子通道 药物筛选 伊布利特 20世纪60年代后期，科学家们发现能够应用微电极测量人工制造的具有双层脂膜的蛋白质单通道电流。这种方法后来被德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann在1976年发展并应用在活细胞上，这就是后来被称为膜片钳的神经生理学技术。膜片钳技术的核心是能够记录单一离子通道电流。玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1-3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已与膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一个极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。目前，膜片钳技术的研究对象不仅局限于离子通道，已经发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞胞吐机制的研究。膜片钳技术的应用也极其广泛，在神经科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生物学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理学、药物研发、药物筛选等方面发挥着重要作用。本文将就膜片钳技术在室性心律失常研究方面的功能加以阐述。 膜片钳记录结果显示，室壁中层的心肌细胞，即M细胞具有独特的电生理特性：如较负的静息电位、较大的O相上升速度、动作电位呈典型的“峰和圆顶且时程很长，无4相自动除极等，这些特点决定了M细胞在折返性心律失常发生中起重要作用。近年来研究心律失常的机制趋向于从膜通道活性异常来阐明。 传统的折返概念认为，折返环路上激动的传导依靠的是0期去极化电流，毗邻细胞的去极化也只能由0期电流介导（即0期折返）。后来发现折返的发生也可以由2期平台期电流介导，并提出“2期折返”的概念。所谓“2期折返”，其细胞机制为：在某些病理状态下，心外膜细胞的瞬间外向钾电流Ito绝对或相对增加，使心外膜某些细胞1期复极终止在较负的电位水平，此时Ito迅速失活而Ica缓慢激活，使2期平台期延迟和缓慢出现，延迟整流钾离子电流Ik依次延迟激活，导致2期振幅增大，顶部后移，复极3期随后发生，因此动作电位时程显著延长。而在心外膜的另一些细胞，由于Ito电流强大，使1期复极终止于更负的电位水平，此时膜电位低于Ica的阈电位，外向电流（Ito和Ik）远远超过内向电流，导致2期平台期的消失，并呈现全或无的复极模式，动作电位时程明显缩短。上述2期平台区与平台丢失区之间的电压梯度如果足够大，局部电流达到阈值，就可在平台期丢失区引起一次新的兴奋。因此，纠正或改变膜电流也就能纠治心律失常。目前，通道或受体已成为抗心律失常药物作用的靶点, 故可应用钠通道阻滞剂( 类) 、受体阻滞剂( 类) 、钾通道阻滞剂( 类) 、钙通道阻滞剂( 类) 来治疗心律失常。虽然抗心律失常的药物很多，但一种药物可能作用于几种通道,往往同一种药物对不同通道的阻滞作用也有很大差别，药物剂量的限定更是一大难题。为此，抗心律失常药物的筛选和药量的界定就显得格外重要。 在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响生理功能的机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。依据室性心律失常的患病机制，采用全细胞膜片钳技术直接记录不同药物及其不同浓度对心室中层M细胞各种离子通道的影响，从而能选择出最为有效的治疗药物和最为合适的服用剂量。近年来研究出的新型III类抗心律失常药物一伊布利特就是通过这种方式发现的。应用全细胞膜片钳记录技术直接记录伊布利特对心室中层M细胞快钠通道的影响，从而探讨其抗室性心律失常的部分离子通道机制。运用该记录方法，记录伊布利特高浓度组(10_5molL)及低浓度组(106molL)干预下心室中层M细胞钠通道活性的变化，包括钠通道电流-电压曲线、稳态失活曲线及失活后再恢复曲线。并与正常对照组进行比较分析。电流记录的刺激程序由pulse+pulsefit软件控制，通道信号经EPC一9膜片钳放大器放大，通过AgAgCI电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-9转换，为pulse+pulsefit软件采集、分析。结果显示，伊布利特抗室性心律失常的电生理机制之一是通过阻断钠通道，并进一步使：可激活的钠通道数量减少，细胞膜的阈值降低，兴奋性降低；降低动作电位振幅，减慢传导速度，控制快速性心律失常；延长钠通道失活后再恢复时间，延长动作电位及有效不应期，减慢传导使折返激动不易形成，从而有效缓解室性心律失常。同时，结果还显示出：伊布利特的浓度与其对钠通道的阻滞作用呈正相关关系。所以，可以依据不同程度的心律失常给予相应浓度的伊布利特。采用同样的记录方式证明，伊布利特还能够有效抑制K+外向电流的作用。通过对K+外向电流的抑制，可延长心肌细胞动作电位时限和有效不应期。此外，促进平台期内向Ca2+内流也是本药区别于其它III类抗心律失常药物的另一个特点，在复极2相时由于Ca2+内流，抵消了部分K+外流的作用，使复极2相出现平台期。最终K+外流速率超过了Ca2+内流，或Ca2+内流停止使复极2相结束。伊布利特通过促进Ca2+内流，也可起到延长动作电位时程的作用。目前，伊布利特已经是一种疗效十分显著的抗心律失常药物。可见，从心肌细胞电生理的揭示到室性心律失常机制的发现，再到室性心律失常相关治疗药物的研制和筛选，膜片钳技术都发挥了举足轻重的作用。然而，这一应用只是膜片钳功能的冰山一角。当前，生理学、生物物理学、生物化学、分子生物学和药理学等多种学科正在把膜片钳技术和膜通道蛋白重组技术、同位素示踪技术和光谱技术等非电生理技术结合起来，协同对离子通道进行全面的研究。不少实验室已经将基因工程与膜片钳技术结合起来，把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常的通道功能而达到治疗的目的。随着膜片钳技术的不断发展，相信膜片钳技术必将在更为广阔的领域为人类的科研事业贡献巨大的力量。参考文献：【1】人体及动物生理学（第3版）王玢 左明雪著 高等教育出版社 2009年 36、209-217【2】动物生理学实验（第2版）杨秀平 肖向红著 高等教育出版社 2009年