螺旋培养条件研究.doc

螺旋培养条件研究.txt45想洗澡吗？不要到外面等待下雨；想成功吗？不要空等机遇的到来。摘下的一瓣花能美丽多久？一时的放纵又能快乐多久？有志者要为一生的目标孜孜以求。少年自有少年狂，藐昆仑，笑吕梁；磨剑数年，今将试锋芒。自命不凡不可取，妄自菲薄更不宜。配方 10 (g.L ) : N aHCO 3, 5; K2H PO 4, 0. 5; K2SO 4, 配方 10 (g.L ) : N aHCO 3, 5; K2H PO 4, 0. 5; K2SO 4, 第25卷第 4期李叙凤等 :螺旋藻培养条件研究 螺旋藻培养条件研究 X李叙凤王长海温少红 (烟台大学海洋生化工程研究所 ,烟台 , 264005)摘要对影响螺旋藻生长的 pH值、营养物质、微量元素及稀土元素等因素进行研究。在最适 pH值范围和优化配方的碳、氮源浓度及比例以及微量元素与稀土元素含量的条件下 ,获得了比较理想的培养结果。关键词螺旋藻培养条件优化螺旋藻(S p iru lina p la tensis)是一种单细胞微藻,属于蓝藻纲颤藻目的一个属 1 ,是一种螺旋状、不分枝的丝状微藻,体长约200500Lm采用Zarrouk。螺旋藻营养丰富,富含蛋白质、维生素、微量元素及对人体有特殊药效功能的多种活性物质等 2 ,因此,以其特有的组成日益引起藻类学家、营养学家和医学界的广泛重视。国际上已将其应用于食品、医药和保健品等诸多领域,是一种有巨大开发潜力和利用价值的多功能产品 3 。但由于螺旋藻产率低、生产成本高,难以广泛推广。国内外螺旋藻专家都在寻求降低生产成本的新途径 4 ,如(1)开发新型光生物反应器:从早期的开放池式反应器 5 (op en pond system )到80年代的密闭式反应器 6, 7 (enclo sed system )及近期的各种新型光生物反应器 8, 9 (p ho tob io reacto r) ; (2)优化螺旋藻的培养条件:通过对营养物质、温度、pH值、光照等参数的优化研究及控制,为螺旋藻的生长提供良好条件,以提高螺旋藻的生长速率和产率,以期达到高产低成本的目的,本文主要从营养条件、pH值、微量元素及稀土元素对螺旋藻生长的影响进行探讨。1材料与方法1. 1藻种钝顶螺旋藻F3品系,原种由中科院海洋种,用对数期的藻液接种。1. 2实验方法1. 2. 1基础培养基18. 0; N aNO 3, 2. 1. 0; N aC l, 1. 0; CaC l2, 0. 04; N a2ED TA , 0. 08; M gSO 4 . 7H 2O , 0. 2; FeSO 4 . 7H 2O , 0. 01;微量元素, 1. 0m l;在300m l三角瓶内装培养液150m l,于9181104Pa压力下,灭菌20m in。微量元素液的配制(g.L ) : H 3BO 3, 2. 86; (N H 4 ) 6M o7O 24, 0. 02;M nC l2.4H 2O , 1. 8; Cu2 SO 4, 0. 08; ZnSO 4.7H 2O , 0. 22。1. 2. 2藻体生长的测量用721分光光度计、1. 0 cm比色杯,在波长560 nm处测量藻液的光吸收值(光密度值)。其生长速度按文献 11 计算。1. 2. 3培养条件光照:采用日光灯个数控制光强,除特别指明外,本实验的光辐照均在2. 03. 0 mW.cm -2范围之内;温度:控制在(251) 的范围。2结果与讨论2. 1螺旋藻液光密度OD 560值与生物量干重第一作者 :硕士 ,讲师。X国家 “九五”科技攻关资助项目收稿时间 : 1999202204,改回时间 : 1999203226 研究所引进 ,实验用藻株是本实验室利用稀释法和平板法进行分离纯化和筛选获得的纯. 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 左右。为左右。为食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol. 25No. 4 (dry weight)的关系用基础培养基大量培养藻体 ,经特制的滤布过滤后 ,用3. 0%的生理盐水洗涤 2遍;然后,用蒸馏水配制成不同稀释倍数的藻液 ,以蒸馏水为参比液测定不同浓度藻液的 OD 560值。然后取干净的离心试管 30支,于烘箱中烘烤2h后编号 ,空气中平衡至恒重 ,称量后加入不同浓度的藻液 ;每一浓度做 3只平行组 ,5 000 r.m in离心 15m in后,弃清液 ;于100温度下烘 3 6h,然后在空气中平衡至恒重 ,用精密分析天平称重后 ,用减量法获得藻体细胞干重。根据实验数据得螺旋藻的藻体细胞干重 (Y)与OD 560值 (X)间一元一次回归方程 : Y= 0. 8233 X-0. 0072式中 : Y-螺旋藻藻体细胞干重 ,g.L; X-螺旋藻培养液光密度 ,OD 560。 2. 2培养基初始 pH值对螺旋藻生长的影响 7Zarrouk培养基的pH值为8. 探讨pH值对螺旋藻生长的影响,在接入藻体后用酸度计分别将培养液的pH值调节为0、8. 0、9. 0、10. .0、11. 0、12. 0,其生长情况如图 1所示。图1初始 pH值对螺旋藻生长的影响图1结果可见 ,培养基的初始 pH值在 7. 0 11. 0碱性范围内 ,螺旋藻培养液的 OD 560值增长趋势均较好 ,尤其是 pH值为 9. 0 10. 0时,螺旋藻培养液的 OD 560值增长最快 ,说明螺旋藻在 pH值为 9. 0 10. 0时,其生长速率最快 ,据此可以判断螺旋藻生长的最适 pH值范围为 9. 0 10. 0。当培养基的初始 pH值为 12. 0时,螺旋藻培养液的 OD 560值基本不变 ,可见此时藻体细胞的生长受到了抑制。这一结果与 Am ha Belay等的观点一致 12 。为验证上述结果并进一步寻求螺旋藻培养的最适 pH值范围 ,在上述实验的基础上进行了进一步的实验。即在最适 pH值范围内将培养基的初始 pH值分别调节为 9. 00、 9. 10、9. 20、9. 30、9. 40,在相同的光强和温度条件下定期测定培养液的 OD 560值,结果如图2所示。图2最适 pH范围下螺旋藻的生长由图 2可见 ,在最适 pH值范围内 ,螺旋藻培养液的 OD 560值增长均很快 ,且增长趋势非常接近 ,结果进一步验证了在最适 pH值范围内 ,螺旋藻的生长速率很快且相差不大,同时也说明了螺旋藻对生长环境的碱性要求不太苛刻。 2. 3营养条件对螺旋藻生长的影响王长海等人的研究表明 ,在螺旋藻培养基的各种营养物质中 ,碳源、氮源的浓度及比率对螺旋藻生长影响较大 13, 14 ,因此在 Zarrouk配方基础上对 NaHCO 3、NaNO 3、 K2HPO 4这3种营养物质按表 1设计的方案进行了三因素三水平正交实验。表1正交实验因素水平表因素 水平A B C (N aHCO 3) (K2H PO 4) (N aNO 3 ) 1 28 0. 8 2. 5 2 18 0. 5 2. 0 3 10 0. 3 1. 5 . 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第25卷第 4期李叙凤等 :螺旋藻培养条件研究 实验共进行了 2次,每次均设 3个平行组。除培养基 3种营养物质成分不同外 ,其它条件与基础培养基相同。培养时间为 5 d,且24 h不间断光照 ,其余培养条件均与文献 14 的实验条件保持一致 ,对获得的实验数据进行了方差分析 ,结果见表 2。表2正交实验方差分析表变异来源平方和自由度均方 F值 NaHCO 3 0. 04570 2 0. 02285 134. 41 K2HPO 4 0. 00433 2 0. 02170 12. 76 NaNO 3 0. 01083 2 0. 00542 31. 88误差 (e1) 0. 00214 2 0. 001076. 29误差 (e2) 0. 00150 9 0. 00017总误差 0. 06450 17查表得 :F0。01 (2. 9)= 8. 02、F0。05 (2. 9)= 4. 26,根据表 2的方差分析结果可以看出 ,A、 B、C三因素的 F值均大于 8. 02,说明在本实验的条件下 ,三因素对螺旋藻的生长均有极表3微量元素对螺旋藻生长的影响表初始 组名组号OD 0OD 2 OD 31 0. 146 0. 439 0. 360 标准对照组 2 0. 044 0. 255 0. 272 标准配方去1 0. 143 0. 350 0. 350 除微量元素 2 0. 053 0. 295 0. 315 显著的影响。其中 , NaHCO 3的影响最大 , N aNO 3的影响次之 , K2HPO 4的影响相对较小。且当 A= 10, B= 0. 8, C= 2. L时,螺0g.旋藻生长速率的平均值最大 ,因此 ,取之为优化配方。 2. 4微量元素对螺旋藻生长的影响一般而言微量元素对微藻的生长有一定的促进作用 ,为了探讨微量元素对螺旋藻生长的影响 ,并验证通过正交实验得到的优化配方对螺旋藻生长的影响 ,设计了以下 2组实验: (1)以 Zarrouk培养基为标准配方做对照组 (A 1),另选 2组分别为去除微量元素组 (B )和由正交实验所获得的优化配方组 (C) ,在同等培养条件下进行了对照培养 ,结果见表3。实验组 OD 560 平均值组内平均总平均0. 253 0. 2370. 220 0. 210 0. 2310. 252 1 0. 063 0. 480 0. 510 0. 432 优化配方组 0. 4332 0. 055 0. 490 0. 490 0. 435 由表 3可见 ,去除 Zarrouk配方的微量元素后培养的螺旋藻的 OD 560值增长量虽然偏低 ,但是与标准对照组相差不大 ,这说明在本实验范围内 Zarrouk配方中的微量元素对螺旋藻的生长影响不大 ;同时可见 ,通过正交实验所取得的优化配方组 ,其 OD 560值增长量明显增加 ,比标准对照组高 1. 8倍。这进一步验证通过营养条件的优化组合 ,对培养基碳、氮源浓度及比例的调整 ,能十分有效地提高螺旋藻的生长速度。 (2)以 Zarrouk配方培养基做对照组 (A 2),分别选择微量元素加倍组 (D )和碳源加倍组 (E)、氮源加倍组 (F ) ,在同等培养条件下进行培养 ,结果如图 3所示。图3微量元素及营养对螺旋藻生长的影响 . 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol. 25No. 4 图4稀土元素对螺旋藻生长的影响实验结果表明 ,加入不同量稀土元素后 ,在藻体细胞生长的初期稀土对螺旋藻的生长影响不十分明显 ;随着培养时间的增加稀土对藻体细胞生长的影响明显增加 ,当L a3+为 30. 0 40. 0 Lmol.L时,螺旋藻的生长速率相对最快 ,且随着培养时间的延长这种趋势更加明显 ,但是当 L a3+高于 400 Lmol.L时反而不利于藻体细胞的生长 ,见图 5。由图3可见,微量元素加倍组(D )培养的螺旋藻的OD 560值增长量与标准对照组相差不大,这进一步验证Zarrouk配方中的微量元素对螺旋藻的生长影响不大;同时可见,碳源加倍组(E )培养的螺旋藻的OD 560值增长比标准对照组明显减慢,这也验证碳源加倍抑制螺旋藻的生长;氮源加倍组F培养的螺旋藻的OD 560值增长量与标准对照组相差不大,即在实验范围内氮源浓度对螺旋藻的生长影响不大。2. 5稀土元素对螺旋藻生长的影响根据文献报道 15 ,稀土元素能提高植物叶片内叶绿素的含量,促进植物的光合作用,从而增加农作物的产量,对螺旋藻的净光和放氧也有明显的促进作用。为了探讨稀土元素对螺旋藻生长的影响,在培养液中添加L aC l3 ,使培养液的L a3+浓度分别达到10. 0、20. 0、30. 0、40. 0、50. 0、60. 0、70. 0、80. 0 Lm o l.L ,其生长情况如图4。图5不同时间稀土元素对螺旋藻生长的影响3结论(1)当培养液的pH值为9. 010. 0时,螺旋藻的生长速率最快;当pH值为12. 0时,螺旋藻基本不生长或生长受到抑制。(2)通过营养条件的优化组合,调整碳、氮源的浓度及比例,能明显提高螺旋藻的生长速率及产量。(3)微量元素的增减,对螺旋藻的生长没有明显影响;但稀土元素对螺旋藻的生长有一定影响,当L aC l3的加入量为3040 Lm o l. L时,螺旋藻的生长速率相对最快。参考文献1蔡宗林1科学之友, 1995, 3 2O rtega2Calvo J J et al. J. A pp l. Phyco lo2 gy, 1993, 5: 425435 3R ichmond A. J. A pp l. 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