膜片钳技术的发展及应用.doc

膜片钳技术的发展及应用作者：生命科学学院2010级 加孜依拉.巴旦1241410034摘要膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的,来反映细胞膜上离子通道活动的一项技术。它对通过离子通道的离子电流进行记录，目前已发展出多种记录模式,广泛应用于神经科学、药理学、细胞生物学，生理学和分子生物学等学科领域。概括了膜片钳技术的基本原理, 归纳出该技术的主要操作步骤，并对其发展与应用进行了总结。关键词 膜片钳 离子通道 电生理 发展及应用一、膜片钳技术的发展史1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100G的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1m的空间分辨率和10s的时间分辨率。1983年10月，Single-Channel Recording一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术的基本原理膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从膜片常规钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到自动化膜片钳技（Automated patch clamp technique）。传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞，对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。膜片钳技术( patch- clam p technique)是在电压钳技术的基础上发展起来的, 采用记录流过离子通道的离子电流, 来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术。该技术可将一尖端经加热抛光的玻璃微电极管吸附只有几平方微米的细胞膜, 在玻璃电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接, 因而可通过微电极直接对膜片(细胞膜小区域)进行电压钳制,而无需使用其它微电极。1976年, 德国生理学家Neher和Sakmann 首先利用此技术研究肌肉细胞膜上的乙酰胆碱受体通道, 记录出了量值在皮安级( 10- 12A)的微弱电流。1981年, Hamil和Neher 等人对最早的膜片钳方法和电子线路做了较大的改进和完善, 使其电流测量的灵敏度达到1pA, 时间和空间分辨率分别达到10s和1m, 并已发展出几种适合不同需要的记录模。三、应用学科膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务，目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。四、应用的标本种类与研究对象使用的标本种类繁多。从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等；从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上。研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。（1）膜片钳技术与荧光技术的结合荧光探针 Fu ra- 2 、 luo- 3 F 、 luo- 4 等 F 常用于检测细胞内的钙离子浓度，能与钙离子结合，产生较强的荧光, 通过膜片微电极将其引入细胞，可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度, 钙离子的释放及内流等情况,研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。（2）穿孔膜片钳技术1988 年 H orn 等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术 ( perforated patch clamptechn ique)：即利用某些抗生素具有 在生物膜上 形成通 透性孔道的性质, 将这类抗生素充灌在电极液 中，在高 阻封接形 成之 后 自发 形成 全 细胞 记 录模 式。该技 术 中, 抗生素形成孔道的有效半径为 0. 4 0. 8 nm，可以 + + + + 选择性地通透 N a 、 、 i 、 、 l 等 一价 离子, 使 K L Cs C 细胞内环境 相对稳 定，电流的衰减现象 减弱。并 且抗 生素对细胞的损伤作用小, 高阻封接不易被破 坏,记录的持续时间延长。这种技术需要在避光条件下配制含有抗生 素的穿 孔液, 配好后于避光保存。充灌电极 时, 先用不含抗生素的电极液充 灌, 然后再加入含有抗生素的电极液反向充灌电极。在这个过程中,应快速形成高阻封接，避免抗生素扩散到电极尖端抑制高阻封接的形成。（3）在体膜片钳技术 在体膜片钳技术主要用于研究感觉系统对外界环境刺激的反应特性和机理。早期膜片钳记录用的大多是急性分离的细胞，到了20世纪90年代, Pe i等 报 道了在整体动物上 进行膜片钳 记录, 从此开创了在体膜片钳技术的研究。在体膜片钳的研究 初期, 以B lanton 和M argrie 为代表的盲法记录不能使电极与细胞膜准确地封接, 带有一定的随机性,从而影响了该技术的准确性。 M argrie 对此 方法做了改进, 采用 TPTP( two- photon targeted patch ing )技术。该技术主要引入双光子显微技术, 并结合荧光标记技术, 使细胞 内微电极的穿透可以准确的定位, 能探测到胞体、树突甚至个别的棘突, 大大提高了实验的准确率和成功率。（4）对单细胞形态与功能关系的研究 将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合，在全细胞膜片钳记录下，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA，再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。目前国际上掌握此技术的实验室较少，我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。 （5）对药物作用机制的研究 在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响,了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。 （6） 在心血管药理研究中的应用 随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路五、发展展望膜片钳技术自建立和发展完善以来, 对细胞膜的电生理研究起到了巨大的促进作用。该技术已成为神经生物学和细胞生物学研究的一种基本方法, 可以对离子通道、信号转导及神经传导系统的机制进行深入的研究, 广泛应用于神经科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理学等多学科领域。近几年来, 膜片钳技术迅速发展, 可以在组织切片靠近表面的细胞上进行记录, 随后又