乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响-养殖专业毕业论文.pdf

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II1前言：111益生菌的发展现状1111益生菌的概念。1112饲用益生菌的作用机理11121刺激免疫反应11122维持正常的肠道菌群11123参与代谢，促进营养物质的吸收2113枯草芽孢杆菌的研究概况。2114乳酸杆菌的研究概况2115益生菌在蜜蜂上的应用312蜜蜂的消化生理4121蜜蜂的消化道4122蜜蜂的消化酶4123蜜蜂的肠道微生物51231蜜蜂肠道正常菌群51232蜜蜂肠道的致病菌513蜜蜂防御病原菌的机制。6131体壁防御61-32活性氧防御6133抗菌肽714本研究的目的和意义72材料与方法821试验材料822试验设计与饲养管理92-3测定指标及方法9231蜂群的采食量。9232日粮中蛋白质的消化率一9万方数据2133蜜蜂消化酶活性的测定10234头胸部的蛋白质浓度10235头胸部的抗氧化性10236中肠形态学指标11237基因表达定量检测112371蜜蜂总RNA的提取和检测112372 eDNA的合成12237-3实时荧光定量PCR分析1323631引物及反应条件的确定1323732实时荧光定量PCR检测基因表达水平1324数据处理133结果与分析1431不同益生菌对不同日龄蜜蜂采食量的影响1432不同菌种对蜜蜂存活率的影响1533不同菌种对不同日龄蜜蜂日粮蛋白质消化率的影响1534不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响1635不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部抗氧化能力的影响16351不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸SOD活性的影响16352不同日龄和不同菌种饲粮对蜜蜂头部MDA的影响17353不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部T-AOC的影响1736不同菌种和不同日龄对蜜蜂中肠胰蛋白酶活性的影响1837不同菌种和不同日龄对蜜蜂中肠厚度和隐窝深度的影响1938不同菌种对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响204讨论：!l41益生菌影响意蜂的采食量2142益生菌影响意蜂的肠道发育2243益生菌影响蜜蜂的寿命和抗氧化能力2244益生菌制剂影响蜜蜂的消化酶活性和体蛋白浓度2345益生菌制剂影响蜜蜂的蛋白消化率2446益生菌影响免疫相关基因的表达24万方数据5总体结论、创新点及展望2551总体结论2552本研究的创新点2553存在的不足及进一步解决的问题256参考文献277致谢328基金资助33万方数据山东农业大学全日制硕士专业学位论文中文摘要使用益生菌制剂对于维护蜜蜂肠道菌群平衡、保持蜜蜂健康具有重要作用。不同的 益生菌对蜜蜂的肠道发育和饲料利用效果不同。本研究选用了两种具有代表性的益生菌 制剂乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌，探究饲喂益生菌制剂对意大利蜜蜂采食量、蛋白消 化率、中肠围食膜厚度、组织抗氧化能力和免疫性能的影响，以期为蜂用益生菌制剂的 选择提供参考。本试验从姐妹蜂王群中取新出房(1日龄)的意蜂3600只，随机分为3个处理组， 每组4个重复，每个重复60只蜜蜂。试验I组为对照组，饲喂普通油菜花粉，试验II 组和组饲喂分别添加了1x108cfukg,L酸杆菌制剂和lxl08cfukg枯草芽孢杆菌制剂的 油菜花粉，为试验组。整个试验期30天，期间均保证糖浆(50蔗糖溶液)和水的充足供应。于试验的第3、6、9天取样，测定存活率，采食量，蛋白消化率，中肠酶活 性，抗氧化能力，免疫相关基因表达量等指标并进行分析。结果表明：(1)油菜花粉 中添加乳酸杆菌制剂和枯草芽孢杆菌制剂对存活率无显著影响(P005)，但饲喂添 加了乳酸杆菌的花粉能显著提高工蜂在6日龄的采食量。(2)在第3、6、9日龄，试 验组相较对照组蜜蜂头胸部蛋白浓度、TSOD活性显著提升(PO05)，MDA活性显著下降(P005)，提示饲料中添加益生菌对蛋白 消化率没有影响。(4)肠壁厚度显著增加、隐窝深度降低、围食膜厚度增加(P005)， 试验组蜜蜂中肠发育情况优于对照组。 (5)在第9日龄，油菜花粉中添加枯草芽孢杆菌制剂和乳酸杆菌制剂均能显著提高Abeacin和Defense两个抗菌肽基因的mRNA表达 量(尸005)，酚氧化酶原PPO基因的表达量降低(PO05)。本研究表明，乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌制剂能够促进意大利蜜蜂的生长发育，提高 蜜蜂消化酶的活性，提高机体的抗氧化能力，提高两个抗菌肽基因和酚氧化酶原基因的 mRNA表达量。关键词：乳酸杆菌；枯草芽孢杆菌；意大利蜜蜂；中肠发育；免疫万方数据乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响Effects of Lactobacillus and Bacillus Subtilis on Development and Immune Functions of Honey Bees(At，is mellifera L)AbstractProbiotics has become a research hotspot of feed additives with the characteristics of safety， lligh efficiencyAt present，the research of probiotics on Italy bee is rareThis study selected probiotics in two representative：Lactobacillus and Bacillus subtilis，to explore the mechanism of action of probiotics in Italy beeIn order to provide reference for the further developmentof bee feed additiveProbiotiCS has become a research hotspot of feed additives with the characteristics of safet， Kgh efficiencyAt presentthe research ofprobiotics on Italy bee is rareThis study selectedp robioties in two representative：Lactobacillus and Bacillus subtilis，to explore the mechanism of action of probiotics in Italy beeIn order to provide reference for the further development Of bee feed additive。Thisexperiment was conducted to study the effects of Lactobacillus and Bacillus subtilis on growth and immune index of Italy beeThe test group from sister queen from the new Apis m ellifera were randomly divided into 3 treatment groups of housing，谢m 4 replications per group，60 chickens in each replicate of beesOne treatment group as control group，fed wim normal rape pollen1卓1 08cfuof Lactobacillus and Bacillus subtilis 1+1 08cfu preparation of rape pollen by adding other two treatment groups were fed respectively，both to ensure adequate SU pply of sugar and waterDetermination ofthe survival rate，feed intake，protein digestibility，i ntestinal enzyme activity，antioxidant ability，expression of immune related genes and other in dicatorsDetermination ofprotein digestibility in honey bees were fed diets after test in the mi dgut ofthe chyme evacuation time based on theThe results showed that：(1)adding Lactobac illus and Bacillus subtilis had no significant effect on survival rate in rape pollen，but pollen W ere supplemented、ri也lactobacillus can significantly improve the worker at the age of 6 dayson feed intake(2)in third，6，9 days，experimental group compared with the difference between the two groups of bees head chest protein concentration，T-SOD activity，MDA activity we re the control(PO05)，significant differences in the 3，9 days of age(P O05)(4)the experimental group compared谢t11 the control group the midgut development b etter，bowel wall thickness increased significantly，and decrease the crypt depth，the peritrophiII万方数据山东农业大学全日制硕士专业学位论文c membrane thickness increased(P005)(5)at ninth days of age，rape pollen adding Bacill US subtilis and Lactobacillus could significantly increase the Abeacin，Defense of two antimic robial peptide gene expression ofmRNA俾005)Expression ofprophenoloxidase gene PPO decreased(PO05)This study shows that，Lactobacillus and Bacillus subtilis preparation Can promote the growth and development of Italy bee bee，improve the activity of digestive enzymes，enhance tlle bodyS antioxidant ability，stimulate the immune system of beesKeywords：Probiotics；Lactobacillus；Bacillus Subtilis；4p括mellifera L；MidgutDevelopment；Immune functionIII万方数据山东农业大学全El制硕士专业学位论文1前言11益生菌的发展现状111益生菌的概念 益生菌的概念随着研究的不断进展在不断的变化。1989年，Fuller将益生菌定义为能够改善肠道微生物平衡，而对动物产生有利影响的活的微生物制剂。随着科学研究的 深入，益生菌的研究不断发展。2001年，联合国粮农组织世界卫生组织(FAOWHO)将益生菌定义为“摄入量足够时对机体产生有益作用的活性微生物”。益生菌的种类很多，目前比较常用的是我国农业部2008年公布的16种饲料微生物添加剂。112饲用益生菌的作用机理1121刺激免疫反应 益生菌是一种很好的免疫增强剂，能够有效的刺激机体的免疫系统。在哺乳动物的研究中，许多结果都能够证明益生菌能够刺激机体的免疫系统。2012年，边连泉等发现 饲喂仔猪一定量的枯草芽孢杆菌能够提高日增重，增强仔猪的体液免疫功能和免疫器官 的发育。Inook的研究也表明以一定剂量的枯草芽孢杆菌饲喂雏鸡能够显著提高T淋巴 细胞的数量。哺乳动物和昆虫对于病原菌的免疫识别系统是相对保守的(Kang D， 1998)。Basset等研究发现以胡萝b软腐欧式杆菌饲喂果蝇，能够刺激果蝇的免疫系统。 Evans等研究发现饲喂乳酸菌制剂能够刺激意大利蜜蜂的免疫系统，上调酚氧化酶原基 因的表达。1122维持正常的肠道菌群在胃肠道的微生态系统中，优势菌群占据着主导地位，维持着正常的肠道菌群。益 生菌作为动物肠道的优势菌群，可以弥补正常菌群的数量，同时通过竞争排斥的机理有 效的抑制致病菌的生长，调节肠道茵群的平衡。Chamber研究发现，益生菌通过与病原 菌竞争营养物质和着附位点，从而排斥病原菌的生长。Giang等研究发现，益生菌能明l万方数据乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响显改良仔猪腹泻，减少了粪样中的大肠杆菌数。Forsgren等通过琼脂平板试验和幼虫生 物测定抑制实验探究蜜蜂肠道内的乳酸茵对幼虫芽胞杆菌的抑制作用。1123参与代谢，促进营养物质的吸收益生菌对于昆虫的营养贡献已经有了初步研究。益生菌对昆虫的营养贡献包括：对 大分子的碳水化合物具有分解作用；促进碳氮营养的吸收，帮助合成维生素等等 (Wenzel M，2002)。在许多种昆虫肠道中都曾分离到降解难溶大分子物质如纤维素、木 聚糖等的细菌。在白蚁和鳞翅目昆虫肠道微生物基因组中发现了多种木聚糖酶基因 (Klnig H J，2006)。金汤东等研究发现EM制剂能提高意大利蜜蜂的胰蛋白酶活性。113枯草芽孢杆菌的研究概况枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，能够产生芽孢，相比于其他益生菌种有易于分离和 培养，利于保存和运输，抗不利环境因素能力强等优点，是优良的益生菌品种。枯草芽 孢杆菌通过芽孢在动物肠道内增殖而起作用，1 980年，Hisanga首次证实芽孢可在兔子胃肠道中萌发，Casula通过检测只在枯草芽孢杆菌生长阶段表达的ftsH基因的方法最终证明芽孢可以在动物肠道中萌发。Duc用大鼠作为试验动物，证明芽孢可以穿过肠黏膜 屏障，转移到了肠系淋巴结。芽孢的转移能够有效的刺激机体的免疫反应，是益生菌的 重要作用机理。枯草芽孢杆菌的芽孢能够代谢产生一些抗菌物质，如枯草菌素(Subtilin) 和凝结素(Coagulin)，也有一些抗生素类的物质，如表面抗菌肽(Surfactin)，伊枯 草菌素A(IturinsA)和溶杆菌素(Bacilysin)等。枯草芽孢杆菌在畜禽上的研究很深入，Fritts使用枯草芽孢杆菌饲喂肉鸡，结果表明21d后体增重明显提高，并降低了需氧性大肠杆菌数。Samanya等使用枯草芽孢杆菌饲喂小鸡，结果表明能提高小鸡的采食 量和食物利用率，显著提高十二指肠和回肠的绒毛长度。边连全等使用枯草芽孢杆菌饲 喂仔猪，结果表明显著提高了日增重，提高机体的体液免疫功能。但是，对于枯草芽孢 杆菌的具体作用机理的探究尚未展开，限制了枯草芽孢杆菌作为益生菌制剂的大规模应用。114乳酸杆菌的研究概况 乳酸杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸命名。它是一群杆状或球状的革兰万方数据山东农业大学全日制硕士专业学位论文氏阳性菌，一般为0510肛m宽，201009m长，微好氧或厌氧，嗜酸性，最适pH为 46。目前已分离出40多种乳酸杆菌。乳酸杆菌的益生作用主要体现在以下几个方面：1提高机体的免疫功能。乳酸杆菌可通过非特异性免疫来具有早期的抗感染作用，特别 是可以增强巨噬细胞功能，还可以增强黏膜的屏障功能，控制炎症反应强度；并可以刺 激机体特异性免疫，增加血清或黏膜中的lgA、lgG、lgM水平，促进B、T两种淋巴细胞的成熟，增强细胞免疫，从而提高肠道抗病力，抵抗疾病。2生物拮抗效应。拮抗效应有着以下几个方面：首先表现在对营养物质的竞争，营养物质竞争的位置处于小肠上 皮细胞，乳酸杆菌是肠道内优势菌种，有限利用小肠食糜的营养物质，限制了有害菌群 的繁殖。其次是对吸附部位的竞争，无论是致病菌还是乳酸杆菌均都是吸附在黏膜上皮 后才能发挥作用，部分致病菌因有益菌与黏膜上皮紧密结合而被排斥在外。再次乳酸杆 菌分泌的细菌素也可以发挥杀菌作用。3提供营养物质。很多研究显示某些谷物经乳酸 菌发酵后营养价值大幅提高。如果乳酸菌在机体内正常代谢，可为宿主提供部分必需氨 基酸和维生素，增强动物营养代谢，促进动物生长。乳酸杆菌在畜禽上已经得到了广泛 的应用，作为猪肠道优势菌群之一，乳酸杆菌对维持猪的肠道稳态有着重要意义。日粮 添；Dn-孚l,酸杆菌显著提高了断奶仔猪的平均日增重及饲粮粗脂肪表观消化率，并且可以预 防并治疗仔猪腹泻。鸡的肠道黏膜上皮黏附有大量乳酸杆菌，从而在小肠黏膜表面形成 屏障，降低了有害菌经由肠道侵染鸡体的概率。益生菌无污染、无副作用及保健功能决 定了其在未来领域必定应用广泛。乳酸杆菌已被证明是动物消化道中的益生菌，对动物 无不良反应，还可通过改善肠道稳态、提高动物免疫力、生物拮抗等机制发挥作用，目 前已被广泛应用于动物生产，前景十分广阔。115益生菌在蜜蜂上的应用目前所使用的益生菌制剂仍然存在许多问题，如在实际养殖过程中不同时期的不同 动物的益生菌添加量没有科学依据、部分益生菌制剂随着贮存时间延长后活力易下降甚 至失活从而导致使用效果不佳，这些都需要科学的探索。作为替代抗生素的新型添加剂，绿色养殖已引起广泛关注。因益生菌不仅可作为动 物添加剂，还能作为人的功能性食品，具有保健、治病的功效，因此被称为“2l世纪的 热门话题”。人和动物体肠道内寄居的大量微生物与机体的生理活动息息相关。饲喂益 生菌可以调节肠道菌群稳态，增强机体免疫，提高饲料利用率，促进机体生长；而益生 菌的使用不会污染环境，有着极其重要的环保意义；益生菌本身无毒副作用，所以对人万方数据乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响类健康也是很有益的。随着社会的发展和人们生活水平的不断提高，人们对环保、卫生 安全和食品安全的问题更加关注，益生菌的应用前景十分广阔。关于蜜蜂肠道菌群的研究已经比较深入，对于蜜蜂肠道菌群的组成和结构分析的比 较透彻。应用蜜蜂肠道固有菌群来进行生物防治的研究已经展开。Gilliam等在研究非 致病性微生物对蜜蜂的影响的时候发现最常见的曲霉菌属真菌对白垩病有抑制作用，并 且蜜蜂肠道内的毛霉菌和根霉菌对白垩病也有一定的抑制作用。Evans等发现乳酸菌能 促进蜜蜂的内在免疫反应以抵抗病原菌的侵入。CoxForster等研究发现蜂群衰竭失调症(CCD)也与蜜蜂肠道菌群失衡有关。12蜜蜂的消化生理121蜜蜂的消化道 蜜蜂的消化道起始于口，终止于肛门，包括前肠(foregut)、中肠(midgut)和后肠(1lindgut)三部分。前肠包括口、咽、食道、嗉囊和前胃，起到接纳、暂时储存和初步 消化食物的功能。蜜蜂的嗉囊主要用于储蜜，又称蜜囊。蜜囊内有来自唾液腺的消化酶 和中肠倒流过来的消化酶，可以对囊内的食物进行初步消化。蜜囊内有稀疏的绒毛，可 以起到过滤的作用，能分开糖浆和花粉，只让花粉进入中肠。前胃是前肠的最后一部分， 主要起对进入中肠的食物进行调节和过滤作用。中肠是消化食物和吸收营养的主要部位。蜜蜂中肠由内向外由围食膜、底膜、环肌、 纵肌和围膜组成。中肠细胞有柱状细胞，再生细胞和内分泌细胞三种，柱状细胞是分泌 消化酶和吸收消化产物的主要功能细胞。围食膜昆虫中肠的一种特殊结构，能够保护中 肠免受食物颗粒和病原微生物的损害，同时能允许分子量较小的淀粉酶和胰蛋白酶通 过，阻止分子量较大的Q葡萄糖酶通过，维持特定部位酶的高浓度，起到分子筛的作用。 蜜蜂的后肠由小肠和后肠组成蜜蜂在越冬期间产生的粪便，都集中储存在直肠中，而直肠 肠腺能够分泌防止粪便发酵腐败的物质，这对蜜蜂长期储存大量粪便而安全越冬意义重 大。122蜜蜂的消化酶蜜蜂的消化酶主要有糖酶和蛋白酶。糖酶主要有n葡萄糖苷酶、B一葡萄糖苷酶和a4万方数据山东农业大学全日制硕士专业学位论文淀粉酶三种酶组成。意大利蜜蜂中肠能分泌葡萄糖苷酶I和II，这两种酶的最适PH 约为5055，这两种酶能够迅速的分解麦芽糖和麦芽三糖，这对于以糖类为主要食物的 蜜蜂来说是非常重要的，也是意大利蜜蜂的主要的消化酶。胰凝乳蛋白酶是蜜蜂中肠中 最为丰富的蛋白酶类，这类酶不依赖Ca离子，最适PH值在7左右。蜜蜂的蛋白酶在 蛹和刚出房的新蜂体内活性比较低，但是出房几个小时后迅速升高，这于蜜蜂出房后开 始采食蜂粮的行为相契合。蜜蜂的蛋白酶活性收到季节、蜂种、蜜蜂的年龄等多个因素 的影响。蜜蜂中肠的柱状细胞是分泌的消化酶的主要细胞，通常通过局部分泌(merocrinc secertion)的方式进入肠腔。123蜜蜂的肠道微生物1231蜜蜂肠道正常菌群 对于蜜蜂肠道微生物区系的研究已经开展的较为深入。早在1974年，Gilliam等就用过传统的分离培养的方法从意大利蜜蜂工蜂的肠道分离出了8株细菌，7株真菌和7 属的酵母菌。随着16sIA技术的发展，通过PCR-DGGE技术分析蜜蜂肠道的微生物 又成为主流。常伟等通过16sRNA技术对我国南方越夏期的意大利蜜蜂的肠道微生物区 系进行了比较系统的分析。随着基因组学技术的不断进步，对于蜜蜂肠道微生物茵群的 分析更加透彻和精准，CoxFors通过宏基因组测序技术发现意大利蜜蜂的的肠道优势菌 群是1r一变形菌门、 厚壁菌门、q一变形菌门。基因组学的研究能够更直观的研究多 组样品间微生物区系的差异，通过现代分子生物学分析和预测的方法对蜜蜂肠道微生物 进行更深入的研究。通过以上的研究我们发现，蜜蜂的肠道结构简单，所以肠道微生物 区系构成并不复杂，酵母菌和芽孢杆菌是蜜蜂蜂体上最主要的微生物。同时也证明，蜜 蜂是一种良好的研究肠道微生物区系的模式生物。蜜蜂肠道的微生物菌群并不是一成不变的，受到季节，食物源，地区等因素的影响(RadaVl997)。1232蜜蜂肠道的致病菌蜜蜂的许多疾病都是由病原菌引起的，其中主要的细菌有幼虫芽孢杆菌，蜂房球菌， 真菌主要是蜂球囊菌。幼虫芽孢杆菌引起的美洲幼虫腐臭病是西方蜜蜂的毁灭性疾病， 一旦蜂群患病就很难治愈。幼虫芽孢杆菌的抗逆性极强，主要原因是其具有7层包围结构。蜂房球菌引起的欧洲幼虫腐臭病广泛发生于所有养蜂国家，中蜂与西方蜜蜂都有可5万方数据乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响能患病。蜂房球菌属于革兰氏阳性菌，能够长久的存货与病虫死尸和蜜粉中。白垩病由 蜂球囊菌引起，1985年世界养蜂大会讲白垩病列为学术会议的主要议题(冯峰，1995)， 随着蜜蜂原种的引进传遍全国各地，对养蜂业危害极大。13蜜蜂防御病原菌的机制131体壁防御蜜蜂的体壁由蛋白质、几丁质、脂类和蜡质组成。其中，几丁质具有抵抗真菌孢子 的功能，同时对孢子的萌发也有一定的抑制作用。蜜蜂中肠的围食膜主要由蛋白质和几 丁质组成，其功能与体壁相似。每个龄期，中肠围食膜都会定期脱落更换。这两层屏障 能够防止大部分的病原菌的侵入。132活性氧防御病原菌侵染哺乳动物时，其上皮细胞会产生活性氧ROS来杀灭病原菌，与之相似， 蜜蜂产生ROS也是重要的免疫途径。活性氧是指包括过氧化氢(H202)、超氧阴离子自 由基(02)、羟基自由基(OH)在内强氧化性的小分子物质，其可由02还原生成， 彼此之间又可以相互转换，对组织和有机体有较强的毒害作用，可以有效杀灭病原物和 寄生虫，在蜜蜂防御病原物入侵和寄生虫寄生过程中发挥重要作用(Miller et a11997； Nathan and Shiloh 2000)。研究人员通过对果蝇的研究建立了病原菌一昆虫相互作用的模 式。当病原物入侵果蝇时，果蝇体内的模式识别蛋白会有效识别外源物，并通过一系列 的调控模式激活基因的表达，合成活性氧(Lemailre et a12007；ValletGely et a12008)。 Heat等研究发现，当肠道上皮细胞收到感染时，就会催使体内产生活性氧来清除病原菌。 在这个过程结束之后，过氧化氢酶又会清除多余的活性氧来维持内环境的平衡 (、letGely et a12008)。通过体外实验，研究人员发现过双氧化酶(DUOX)同源结 构域(PDH)又可以将活性氧的H202催化生成氧化性更强、更具杀菌活性的的HCIO (Lemaitre andHoffmann2007)。Ha等人敲除了DUOX基因后发现活性氧的生成受阻， 不能杀灭入侵的病原菌，果蝇的存活率明显降低。而当敲除过氧化氢酶 (ImmuneResponsive Catalase，IRC)时，与对照相比，果蝇的成活率依旧显著降低，这 表明活性氧对机体本身也有很大的毒害作用，因此维持体内活性氧的平衡十分关键。病万方数据山东农业大学全日制硕士专业学位论文原物的侵染会激活这些关键基因的表达，产生活性氧，杀灭病原体，而昆虫体内的氧化 压力则调控有机体的氧化平衡，从而在有效抵御病原物入侵的同时保护有机体免受强氧 化条件的损害(Ha et a12005；Ryu et a12010)。除了双氧化酶(DUOX)，NADPH氧 化酶(NADPH Oxidase，NOX)也是参与这个过程的重要的酶。NOX是一种含有血红 素的跨膜蛋白，可跨膜运送电子，NADPH作为电子供体通过NOX作用将电子转移给 氧，生成超氧阴离子02，产生的活性氧具有强氧化性，能够有效杀灭病原物(Segal， 2008)。随着活性氧研究的深入，超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)和过氧 化氢酶(Catalase，CAT)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)，三者协同作用，对抗生物体 内的氧化压力，以避免强氧化压力对宿主本身生物组织造成的伤害。133抗菌肽众所周知，哺乳动物的免疫系统由特异性免疫和非特异性免疫系统组成，但蜜蜂的 免疫系统比较简单，只有非特异性免疫系统，抗菌肽就是其中非常重要的一环。抗菌肽 自上个世纪末被研究人员从蜜蜂体内分离出来以后就成为研究的热点，因为蜜蜂的抗菌 肽具有广谱抗菌的效果，对细菌、真菌、病毒等多种病原体都有很强的拮抗作用。抗菌 肽能够非特异性的与病原菌结合，通过破坏病原菌细胞膜的完整性来杀灭病原菌，Locky 通过电镜观察证实了这一点。但是抗菌肽对病原是否有特异性的识别，抗菌肽同其他抗 菌因子的协同作用等方面还有待进一步的探究。意大利蜜蜂的抗菌肽编码基因主要由 Apidaecin、Abeacin、Hymenoptaecin和Defensin四个基因家族编码而成。这四种抗菌肽都已经被研究人员从蜜蜂体内分离成功。2006年，蜜蜂的全基因组序列发布，关于这四 种抗菌肽基因的研究也更为深入和广泛。Apidaecin类抗菌肽与Abeacin类抗菌肽结构和 功能相似，其前体物质均比较简单，当蜜蜂收到病原体侵染时，这两类抗菌肽均能快速 的表达。这两类抗菌肽对大部分的革兰氏阴性菌和一部分革兰氏阳性菌都具有良好的杀 菌作用。Defensin类抗菌肽在蜜蜂体内的表达量较少，而且需要有大量的病原菌刺激才 会表达，但是这类抗菌肽能够有效的对抗许多革兰氏阳性菌，这是其他抗菌肽所不具备 的能力。14本研究的目的和意义我国是养蜂大国，蜂群数量和蜂产品数量都位居世界第一位。多样的蜂产品丰富了7万方数据乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响百姓的食谱，也为蜂农带来了客观的经济收入。同时，蜜蜂作为一种授粉昆虫在生态农 业的发展中也起到关键的作用。益生菌是一种绿色、高效的微生物添加剂，在畜禽的生 产中已经得到了广泛的应用，并取得了良好的效果。目前，我国养蜂业使用人工饲料已 经成为常态，但是益生菌在蜜蜂的应用还很少。本试验选用目前在养蜂生产中占主要地位的意大利蜜蜂为研究对象，通过使用添加 了益生菌的花粉饲喂离群蜜蜂来探究益生菌对蜜蜂生长发育的影响。通过存活率、肠道 发育、中肠消化酶活性、抗菌肽基因的表达量等指标从营养的角度来评价乳酸杆菌和枯 草芽孢杆菌这两个特定的益生菌种对意大利蜜蜂的益生作用。为蜜蜂人工饲料添加剂的 发展提供一定的理论依据，为蜜蜂专用微生态制剂的筛选研究打下基础。2材料与方法21试验材料试验动物取自山东农业大学试验蜂场的本地意大利蜜蜂(Apis mellifera L)。 试验饲粮：油菜花花粉(粉碎，过40目)、蔗糖、去离子水。 乳酸杆菌制剂与枯草芽孢杆菌制剂购自宝来利来生物公司。 试剂及耗材：蛋白定量测定试剂盒(南京建成)；微量丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒(南京建成)。4福尔马林溶液； 95乙醇；75乙醇；二甲苯；苏木精，伊红，中性树胶，冰醋酸；蒸馏水；双蒸水， 盐酸，硝酸；生理盐水；福林酚；石蜡；TrisHCl(pn 79)：蔗糖；去离子水。试验仪器：高温烘箱，电热恒温水浴锅(HHS，上海)，核酸蛋白检测仪(eppendorf, BioPhotometerplus)，原子吸收分光光度计(AAS)(仪器型号：AAS一18080)，J230023 型电子天平，T6新世纪紫外可见分光光度计，电子秤(ACSZL)，茂福炉(SX2410)， 低温离心机(eppendorf，Centrifuge5810R)，小型高速离心机(eppendorf,Centrifuge5424)，BMJ23包埋机，轮转式石蜡切片机(LEICA RM2135)，显微照相机(PM一20)，光学显 微镜，恒温培养箱，全自动样品快速研磨仪(上海净信科技，Tissuelyser-24)，超低温 冷冻冰箱。万方数据山东农业大学全日制硕士专业学位论文22试验设计与饲养管理本试验于2014年7月23日10月12日在山东农业大学动物营养实验室进行，其中 预试期25天，正试期50天。本试验从姐妹蜂王群中取新出房的意蜂3600只，随机分 为3个处理组，每组4个重复，每个重复60只蜜蜂。试验I组为对照组，饲喂普通油 菜花粉，试验II组和III组饲喂分别添加了l108cfukg乳酸杆菌制剂和1108cfukg枯 草芽孢杆菌制剂的油菜花粉，均保证充足的糖和水的供应。实验二测定蜜蜂头部和胸部 的抗氧化指标及中肠形态学指标，试验分3个处理组，每个处理组3个蜂盒，即三个重 复。取第3、6、9日龄的蜜蜂解剖头部和胸部存样，解剖腹部取中肠。其中的两个处理 组分别饲喂新鲜的磨碎过目的油菜花花粉，保证充足的水和糖水，对照组只饲喂糖水(白 砂糖+蒸馏水)和蒸馏水。试验开始前对室内培养箱进行酒精和紫外消毒，灭菌。随机 分组处理好后，全部置于30。C、60湿度恒温培养箱内饲养。油菜花花粉粉碎后过40 目，50蔗糖溶液按l：1比例充分混匀。将配制好的油菜花花粉日粮分成若干小份置于 盖玻片上，精确称重，每个试验组饲喂一份日粮，多余日粮放于20冰箱中贮存。试 验过程糖水和饲粮均保证充足、新鲜(少量多次)，所有蜜蜂均自由采食水。23测定指标及方法231蜂群的采食量 记录每次饲喂日粮的始料重和余料重，统计每个处理平均每只蜜蜂整个试验期的采食量。232日粮中蛋白质的消化率 将配制好的油菜花花粉日粮分成若干小份置于盖玻片上，精确称重，每个试验组饲喂一份日粮，3天后取出称余料重，每个测试期为三天，共三个测试期。测试期内枯草杆菌组和乳酸杆菌组的50的糖水中各加入1108cfu的菌种混匀后饲喂蜜蜂。试验期 结束后各组蜜蜂饥饿3天后解剖取直肠内容物，放于盖玻片上测定饲粮中蛋白质的消化 率。日粮蛋白质的消化率采用凯氏定氮法。日粮中蛋白质的消化率()=(食入日粮中蛋白质的量直肠内容物中蛋白质的量)万方数据乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响食入日粮中蛋白质的量xi00 233蜜蜂消化酶活性的测定分别对枯草芽孢杆菌组，乳酸杆菌组以及对照组的3日龄、6日龄、9日龄意大利 蜜蜂测定其蔗糖酶，脂肪酶和淀粉酶活性。20中