蛋白质的定量法与标准曲线的制备.doc

蛋白質的定量法與標準曲線的製備A. Folin-phenol(lowry method)定量法此法以Biuret方法反應為基礎發展而起，因此會嚴重干擾Biuret測定方法的因子都會影響此測定法的準確度。這些干擾因子包括：含-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-CH2OH，-CHOH-CH2NH2等基團的物質以及緩衝劑如Tris、蔗糖、低濃度的酚類、檸檬酸等，但低濃度的尿素、硫酸胺可以增加碳酸鈉-氫氧化鈉的濃度來校正顯色結果。1951年Lowry對於 Folin-Ciocalteu 試劑在不同的 pH值條件下得到此試劑作用的最佳反應條件，此法的靈敏度較Biuret方法高約100倍，反應時間只要約15分鐘即可顯色，顏色的穩定度可達數小時，故目前多用Folin-phenol法測定待測樣本的蛋白質濃度。 原理：蛋白質與Folin試劑作用分成兩個階段：1. 蛋白質 先與鹼性銅離子作用 Cu2+ + Protein- Cu-Protein當鹼性的銅離子試劑和蛋白質中的 peptide bond反應時會產生biuret test 的初步呈色反應，此蛋白質銅複合物會再由Phosphomolybdic-phosphotungstic試劑(Folin-Ciocalteu Reagent)作用形成藍色物質。蛋白質分子中可和Folin Ciocalteu 試劑作用的團基有：Histidine的Imidazole Group、Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group、Cysteine的Sulfhdryl Group、Arginine的Guanidino Group。在這些團基中，Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group最為重要，鹼性蛋白質與Folin-Ciocalteu Reagent複合物的顏色強度與蛋白質中的芳香族官能基 (aromatic group) 成正比。值得注意的是當Folin-Ciocalteu 試劑在強鹼的環境中易使 phosphomolybdate解離而喪失作用的能力，所以此劑須新鮮配製並避免與蛋白質中的 Tyrosine 及 Tryptophan 反應前置於強鹼的環境中，依比色的方法測其吸光度，換算蛋白質的量。 注意Folin-Ciocateu phenol 試劑在酸性環境中才穩定，但 Lowry method 必須在 pH=10 才會發生，所以 Folin - Ciocalteu Reagent 一加入鹼性的硫酸銅-蛋白質溶液中(alkaline cooper protein )必須馬上混合均勻，以確保還原反應在phosphomolybdic- phosphotungstate 分解之前發生。以上兩種蛋白質顯色定量法均會破壞樣本中的蛋白質，故當蛋白質樣本量少又需要回收時，不可以使用此種方法定量。B.紫外線吸收值測定法由於蛋白質分子中多含有芳香族胺基酸（如苯丙胺酸(phenylalanine)、色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine) ）殘基，這些殘基含有具共軛電子的苯環團基，故在紫外線波長280nm、260nm會有吸光值。在波長280nm之吸光值與蛋白質的濃度具正相關性，故可以利用280nm的吸光值做為蛋白質的定量工具。此法的優點是迅速、簡便，不消耗樣品及不受低濃度的鹽類干擾。但此種測定方法的缺點是，許多其它物質在此波長附近亦有吸光現象，如核酸雖在260nm會有最大吸光值，但在280nm處仍會有吸光的現象。一般而言，純的蛋白質之280nm/260nm比值約1.75，但此數值會依蛋白質含方香族胺基酸含量而變，因此利用此方法測定蛋白質的濃度最大的缺點是，對於測定那些與標準蛋白質中色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine)含量差別大的蛋白質，測定的濃度會有一定的誤差；再者，樣品中如果又含有核酸等吸光物質時亦會出現大的干擾。因此待測樣本或標準液在作適當的稀釋並在波長280nm及260nm測得吸光值後，可以利用下列的公式以校正蛋白質的濃度。公式：蛋白值濃度(mg/ml) = 1.45A280 - 0.75A260Folin-phenol(lowry method)定量法A. 試劑與儀器： 溶於1. reagent A：100g NaCO3 1L 0.5N NaOH 。 溶於2. reagent B： 1g CuSO45H2O 100mL ddH2O。 溶於 3. reagent C： 2g NaKC4O64H2O 200mL ddH2O。 此三溶液分別儲存。4. bovine serum albumin solution 300 ug/mL ( W/V)5. 平口試管13支6. 試管振蕩器7. Spectronic 20光電比色計8. 安全吸球9. 玻璃刻度吸管10. 微量吸管輔助器B. Lowry method 操作步驟：1. 將 Spectrophotometer 溫機。2. 取 bovine serum albumin solution 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1mL 及未知蛋白質樣本 1mL 置於已標好的試管中。3. 在上步驟的試管中加入蒸餾水使試管中的體積為 1mL 。 此時取 15mL 的 reagent A 與 0.75mL reagent B 及 0.75mL reagent C 混合均勻成為 reagent D。4. 取 1mL reagent D 加入步驟 3 之各試管中，馬上以試管振盪器混合均勻。5. 將混合液置於室溫 15 分鐘。 此時取 5.0mL 2N Folin-phenol reagent 加入 45mL ddH2O，混合均勻。6. 取 3mL 稀釋的 Folin-phenol reagent 加入步驟 5 之試管中，馬上以試管振盪器混合均勻。7. 將混合液置於室溫 45 分鐘。 呈色後之產物 4560 分鐘顏色穩定。8. 在波長 540nm 及 750nm 下分別測其吸光值。9. 分別以 A540、A750 濃度 ug/mL 作表、作圖。求得線性迴歸方程式，並由方程式求出未知蛋白質的濃度。還原糖標準曲線的製備與a-amylase 活性測定還原糖的定量測定與糖濃度標準曲線的測定：3,5-dinitrosalicylic acid定量法利用葡萄糖作為還原糖的單位：以3,5-dinitrosalicylic acid法鹼性的環境下會被還原成3-amino-5- nitrosalicylic acid，來檢測還原糖的存在。材料與儀器：1. 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) 試劑（此藥劑必須新鮮配製）： 配製法： (1). 先將Sodium potassium tartrate 300g溶於500ml的蒸餾水中。(2). 取 3,5-dinitrosalicylic acid 10g溶於200ml 2M的NaOH溶液中。(3). 將(2)之鹼性3,5-dinitrosaliylic acid溶液慢慢加入(1)之溶液中。加蒸餾水至 體積1000ml。 2. 1M NaOH3. 1000mM之glucose。4. 試管震盪器5. 螺旋試管20支6. 試管架7. 水浴槽8. 安全吸球9. 玻璃刻度吸管10. 光電比色計步驟：A.1. 取不同糖試液3ml置於螺旋試管中。（如表一）2. 加入DNSA試劑1ml，混合均勻。3. 在95OC水浴中加熱3分鐘。4. 取出試管冷卻，觀察其顏色變化。5. 用光電比色計測波長540nm下之吸光值。6. 反應之廢液倒入指定的廢液筒。表一：依下表配製不同濃度的glucose溶液：Tube NO1234567Glucose(ml)0.10.20.40.60.81.00H2O(mL)3.93.83.63.43.23.04.0 算出glucose mmole與540nm下吸光值之線性迴歸方程式。a-amylase 活性測定材料：1. 0.1M Na,K-phosphate buffer pH=6.7 ( 0.1M Na2HPO4 與 0.1M KH2PO4 以43.5：6.5(V/V)混合即可。2. 0.01%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.、0.5%、1%、2% Glycogen溶於內含0.01% NaCl的0.1M Na,K-phosphate buffer中。3. 2N NaOH(停止反應)。4. 60% Na,K-tartrate。5. 1% dinitrosalicyclic acid 溶液(DNSA)。6. 5U/ml a-amylase溶液。註：1. 0.5% Glycogen基質之配製。5克Glycogen溶於500ml蒸餾水，攪拌均勻加緩衝液加至體積一升。(Glycogen溶解速度慢需於實驗前配製好)2. DNSA之配製：5%之3,5-dinitrosalicyclic acid(溶於2N NaOH)以水作5倍稀釋或以60% Na,K-tartrate溶液作 2：5(V/V)稀釋及即可。步驟：1. 取Glycogen基質3ml置於 25oC 水浴槽中預熱3分鐘。（可在室溫操作）。2. 取出加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5l a-amylase溶液(或是純化步驟中稀釋之收集液)加入各管，混合均勻後置於25oC 水浴槽3分鐘。（酵素液應儲放於冰上）3. 將反應液取出加入 1N NaOH 1ml後加以混合以停止酵素反應。4. 待最後一管完成後，全部之反應的試管加入 1ml DNSA，混合均勻。5. 將試管置95OC 3分鐘，冷卻之至室溫後，在 540nm 讀取吸光值。 計算a-amylase之活性單位： 酵素的活性單位表示法 表二：酵素活性單位(unit of enzyme activity)的表示表示法定義說明國際單位在一定條件下，每一分鐘消耗一定量的受質或生成一定量的產物所需的酵素量稱為一個單位。每分中消耗或生成mmol(10-6mol)；n mol(10-9 mol)；p mol(10-12 mol)的國際單位分別是mU，nU，pU。轉變數(turnover number)在一定的條件下，酵素分子每一催化中心的催化產生產物的分子數即其轉變數。轉變數=產物的分子數/酵素分子催化中心的數目a. 轉變數