与灵芝三萜合成相关的细胞色素P450单加氧酶基因的克隆.doc

与灵芝三萜合成相关的细胞色素P450单加氧酶基因的克隆摘要：灵芝(Ganoderma lucidum)是我国最著名和最具经济价值的药用真菌，灵芝三萜是灵芝的主要有效成分之一，具有抗肿瘤和免疫调节等多种功效，是新药研发的重要源泉。但是其单体难以通过化学分离或合成方法大量获得已成为灵芝三萜类药物研发的主要瓶颈，采用合成生物学思路在微生物中构建异源次生代谢途径是解决这一问题的有效途径。这一策略首先要解决的问题是灵芝三萜次生代谢途径中关键酶基因的获得及功能描述，细胞色素P450单加氧酶便是该途径中最为重要的关键酶之一。本实验根据由灵芝全基因组序列分析获得的细胞色素P450候选基因序列设计引物，以灵芝菌丝cDNA 为模板进行PCR 扩增反应，成功获得单一的扩增产物，且其大小与预期相一致。进一步通过T - A 克隆、大肠杆菌转化、菌落PCR 及测序等工作验证其序列正确性，最终挑选出一条与原始序列完全一致的单克隆，可用于后续表达及功能验证等相关研究。鉴于细胞色素P450 在灵芝三萜生物合成途径中发挥的巨大作用，本实验所获之克隆可以为灵芝三萜合成生物学研究提供重要的数据参考和借鉴。关键词：灵芝三萜；细胞色素P450；基因克隆；合成生物学Cloning of Cytochrome P450 monooxygenase involved in the biosynthesis of triterpenoids from Ganoderma lucidumAbstract：Ganoderma lucidum is the most famous medicinal fungus with the most economic value in China. Triterpenoids are one of the major group of bioactive components found in G. lucidum. Modern pharmacological research has demonstrated that G. lucidum triterpenoids have multiple therapeutic actions, including antitumor and immunomodulatory activities, suggesting they are important source for R&D of novel drugs. However, the difficulties in separation and chemical synthesis in large scale have greatly limited R&D of G. lucidum triterpenoid-derived drugs, and one useful method to solve this problem is to apply the principle of synthetic biology to constructing heterologous secondary metabolic pathway in the microorganism. The primary problem of this strategy is obtain and characteristic describe of the key enzyme involved in the secondary metabolic pathway of G. lucidum triterpenoids, and cytochrome P450 monooxygenase is one of the most important key enzyme of this pathway. In this experiment we design primer according to candidate P450 gene sequence obtained from the analysis of G. lucidum genome, and do PCR amplification use G. lucidum hypha cDNA as the template. As the result we successfully get a unique amplification product which has the same size as long as we expected. Further experiments such as T-A cloning, E. coli transformation, colony PCR and sequence sequencing were did to confirmation the veracity of the cloned sequence, and finally we selected a monoclonal which selfsame with the original sequence and so can be used for the further research about expression and function confirmation of P450. In consideration of the significance of cytochrome P450 in the biosynthesis of G. lucidum triterpenoids, the clone obtained in this experiment may provide valuable reference data and models for synthetic biology research of G. lucidum triterpenoids.Key words: Ganoderma lucidum triterpenoids; cytochrome P450; gene cloning; synthetic biology引言灵芝为担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyproraceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(G. Japonicum)的总称。灵芝作为我国传统的药用真菌，几千年来一直被用于疾病治疗和延长寿命，具有悠久的药用历史1-2。对于灵芝的药用记载最早出现在两千多年前的神农本草经中，目前灵芝已被美国草药药典与治疗纲要（American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium）收录3，其药用价值已得到世界各国的广泛认可。灵芝中含有多种生物活性物质，截止目前，已有400多种不同的化合物被鉴定出来4，包括150余种萜类化合物5、灵芝多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸等，因此灵芝又有“生物活性成分细胞工厂”之称2。现代药理学研究已经证明，灵芝具有多种重要的医学价值2, 5-10，例如抗肿瘤8-10、降血压、抗病毒以及增强免疫能力等，其在疾病治疗、新药研发等领域中具有广阔的应用前景。1 灵芝三萜生物合成途径及关键酶灵芝三萜与灵芝多糖是灵芝药用活性成分的主要组成部分。同位素标记实验显示：灵芝三萜通过甲羟戊酸途径（Mevalonic Acid Pathway，MVP）合成4, 11-12，羊毛甾醇是所有灵芝三萜和麦角甾醇（真菌细胞膜的重要组分）的共同环状前体，但是目前对于灵芝三萜下游特异性合成途径的研究还是空白，对于从单一前体羊毛甾醇形成种类繁多的灵芝三萜的分子机制还不清楚11。中国医学科学院药用植物研究所陈士林课题组分析了所有已知灵芝三萜的结构和基团修饰，首次提出了灵芝三萜的完整合成途径，并认为参与灵芝三萜下游途径的修饰酶主要来自于细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenases，CYP450）、乙酰基转移酶（Acetylase，AT）和甲基转移酶（Methyltransferase，MT）等超基因家族。灵芝三萜生物合成的甲羟戊酸途径（MVP）主要分为三个阶段：以糖酵解产物乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）作为原初底物，经过甲羟戊酸（Mevalonic Acid，MVA）中间产物合成异戊烯基焦磷酸( Isopentenyl diphosphate，IPP )和 , -二甲丙烯基焦磷酸( Dimethylally diphosphate，DMAPP )；经过烯丙基转移酶（Prenyltransferase）和萜类环化酶的催化生成2 , 3 - 氧化鲨烯（2，3-oxidosqualene）；由氧化鲨烯环化酶（Oxidosqualene cyclase，OSC）催化 2 , 3-氧化鲨烯生成羊毛甾醇（Lanosterol）。羊毛甾醇再经过一系列的氧化、甲基化、乙酰化等步骤，生成种类繁多的灵芝三萜类化合物，催化这些反应的主要酶类就是CYP450 以及甲基转移酶（MT）、乙酰基转移酶（AT）等。灵芝三萜生物合成途径相当复杂，参与其中的关键酶、限速酶亦数目繁多。3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）催化3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A（HMG - CoA）形成甲羟戊酸（MVA），是萜类合成途径中最早起作用的关键酶，也是第一个限速酶13。法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase，FPPS）催化一分子的异戊烯基焦磷酸（IPP）和牦牛儿基焦磷酸（Geranyl pyrophosphate，GPP）合成法呢基焦磷酸（FPP），该基因受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）诱导表达量升高14。鲨烯合成酶（Squalene synthase，SQS）催化两分子的法呢基焦磷酸（FPP）中间体缩合生成鲨烯，受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导15，同时过表达鲨烯合成酶（SQS）基因可使甾醇和三萜类化合物合成途径下游基因表达量上调16，如：鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase，SE）基因、羊毛甾醇合成酶（Lanosterol synthase，LAS）基因、细胞色P450(CYP450)基因。鲨烯环氧酶（SE）催化鲨烯生成2,3-氧化鲨烯，是合成甾醇和三萜类化合物的第一步氧化反应，是该途径的限速酶之一，沉默或抑制SE的表达，会降低三萜化合物的积累，对甾醇的合成并无影响17。氧化鲨烯环化酶（OSCs）家族催化2, 3- 氧化鲨烯环化生成结构、功能各异的植物甾醇和三萜类骨架，被认为是植物甾醇和三萜化合物生物合成的关键分支点，羊毛甾醇合成酶（LAS）参与灵芝三萜生物合成途径。羊毛甾醇合成酶（LAS）可催化2, 3- 氧化鲨烯环化生成羊毛甾醇，是进入灵芝三萜合成途径的第一个关键酶。其后CYP450与甲基转移酶（MT）、乙酰基转移酶（AT）将对灵芝三萜碳环骨架进行一系列氧化、甲基化、乙酰化等复杂的修饰，进而生成种类繁多的灵芝三萜类化合物单体。 近年来，多位学者已经展开了对灵芝三萜合成的MVP 途径中关键酶基因的克隆及特征描述等相关研究，并取得了显著的进展。Hongmei Luo 等构建了灵芝子实体 cDNA 文库18，并对其做表达序列标签（Expressed Sequence Tag， EST）分析。研究人员从文库中随机抽取了1023 个克隆，最终获得879 条高质量的ESTs，经序列比对后发现这些ESTs 与多种已知功能的基因具有极高的相似度，其中包括编码鲨烯环氧酶（SE）以及法呢基焦磷酸合成酶（FPPS）的基因。Changhua Shang 等19从灵芝中分离得到了编码 3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶（HMGR）的基因，并获得了其cDNA 全长以及基因组序列全长。HMGR 的cDNA 序列（GenBank 登记编号：EU263989）中开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）全长为3681 bp，编码一条包含1226个氨基酸的多肽链；HMGR 的基因组DNA 序列（GenBank 登记编号：EU263990）全长为4262 bp，包含7个外显子和6个内含子。此外，Ding YX14 等以及Zhao MW20 等则分别从灵芝中克隆得到了法呢基焦磷酸合成酶（FPPS）编码基因的cDNA 序列全长以及鲨烯合成酶（SQS）编码基因的cDNA 序列全长和基因组序列全长。这些基因的获得对后续进行灵芝三萜生物合成途径的异源构建及表达等相关研究提供了极其宝贵的数据和资料。2 细胞色素P450候选基因的挖掘及功能验证细胞色素P450 超家族是在萜类化合物以及其他代谢产物的生物化学转化过程中最为重要的酶系之一21-22，是一类具有多种催化功能的含血红素的氧化还原酶系，广泛分布于各种需氧生物体内，如植物、动物、真菌以及细菌等。自1958年首次报道大鼠肝微粒体上存在CYP450之后，1969年Frear D.S. 等人23首次报道了植物(棉花)中也存在CYP450。此后各国科学家不断的进行CYP450的相关研究，不断有新的CYP450被发现和报道。对CYP450的分类和命名根据基因编码的氨基酸序列的相似性进行的，如果一个新发现的P450基因的氨基酸序列与其它已知P450 的氨基酸序列一致性大于40%，则它们属于同一个家族，否则该P450就属于一个新的P450家族。如果两个P450的氨基酸序列一致性大于40%而小于55%，则它们分属于同一个家族的两个不同亚家族；如果两个P450的氨基酸序列一致性大于55%，则它们属于同一个亚家族。等位基因的氨基酸序列同源性不小于97%24。截止目前，植物中共有5100个CYP450s被分类和命名25。已有研究表明，CYP450是高等植物中最大的酶蛋白家族，不仅参与植物体的基础代谢过程，还参与了植物的次生代谢过程，主要表现在次生代谢物质（如萜类、黄酮类、香豆素、异黄酮类氰甙、生物碱等）的合成以及外源化学药物毒性的降解两个方面24,26。CYP450催化的代谢途径可以产生一些重要的次生代谢产物，使植物具有抵抗病虫害及逆境胁迫的能力。此外，CYP450具有多种不同的催化机制，对多种底物表现出催化活性，参与的催化反应包括羟基化、环氧化和脱烷基化反应等27。广阔的催化底物范围、灵活的催化机制使得CYP450在植物代谢过程中发挥着不可替代的重要作用。然而由于绝大多数CYP450在植物体内的含量很低且通常不稳定，直接分离纯化CYP450单加氧酶非常困难，因此克隆CYP450基因，研究CYP450基因的表达与调控，通过异源表达、突变体互补和缺失突变等方法研究CYP450的功能就成为一条重要途径24。表达序列标签（EST）技术在代谢途径关键酶基因的挖掘方面是一个十分重要的方法。近年来，多位学者利用基于EST的测序分析技术，已经成功的挖掘出来自人参28、丹参29、西洋参30、三七31、灵芝等物种的多条CYP450候选基因，为进一步研究其功能奠定了基础。例如，Shilin Chen， Chao Sun， Hongmei Luo 等通过基于高通量测序454 GS FLX 的EST 分析，获得人参中参与人参皂苷骨架合成的133个细胞色素P450候选基因28；在丹参中，获得了可能参与丹参酮和丹酚酸合成的细胞色素P450 序列70条29；此外，通过茉莉酸甲酯诱导实验以及基于real-time PCR 的组织特异性表达模式分析，确定了西洋参中最有可能参与人参皂苷骨架合成的1个细胞色素P450基因及4个UDP-糖基转移酶基因30。这表明基于EST 的序列分析技术能够很好的用于代谢途径中关键CYP450 基因的挖掘。加州大学伯克利分校的Jay D Keasling 等在从黄花蒿（Artemisia annua L）中发现了一个新的CYP450（CYP71AV1），可以催化从紫穗槐-4,11-二烯（Amorpha-4,11-diene）到青蒿素（Artemisinic acid）的三步氧化反应32。研究人员将这个新的CYP450 基因转化到已经构建了异源甲羟戊酸途径（MAP）的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株里，首次成功利用植物来源的CYP450 基因实现了有功能的萜类化合物在E. coli 中的体内（in vivo）合成33。这项研究为后续CYP450 候选基因以及其他代谢途径关键酶基因的异源表达及功能验证提供了很好的借鉴和参考，也证实了通过基因克隆与异源表达研究CYP450 功能这一策略的可行性。3 研究目的和意义灵芝三萜作为灵芝发挥药用功能的主要活性物质，由于其种类繁多，在灵芝体内含量低微且提取十分困难，化学合成亦困难重重，因此长期以来一直处于供不应求的状况。近十年逐渐成为研究热点的合成生物学为解决这一问题提供了一种行之有效的思路34-36。合成生物学将工程学思想融入到了现代生物学的理论中去，通过筛选和改造生物学元件，建立标准化的生物元件库，人工设计并构建天然产物异源次生代谢途径，最终实现目标化合物的高效异源合成37-38。然而在构建灵芝三萜的异源生物合成途径之前，我们必须对其合成途径有足够的了解和认识，必须获得灵芝三萜生物合成途径中关键酶基因的克隆，并对其进行适当的改造，使其成为可供利用的合成生物学元件，进而实现异源生物合成途径的构建以及表达调控等后续研究。与灵芝三萜合成相关的CYP450 单加氧酶便是灵芝三萜生物合成途径中至关重要的一类，其克隆的获得对开展后续合成生物学研究具有极大的推动作用。与此同时，该实验也有利于建立相应的合成生物学研究策略及体系，以推动进一步的植物天然产物次生代谢途径合成生物学研究，为使更多植物来源的天然产物类药物（如抗疟疾药物青蒿素、抗肿瘤药物紫杉醇）实现成本低、速度快的高效异源生物合成提供理论基础，从而更好的用于人类的健康保障与疾病治疗。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料本实验所用灵芝菌种为中国医学科学院药用植物研究所提供，以组织培养获得的灵芝单倍体菌丝为材料提取 Total RNA。1.1.2 酶及化学试剂 Pyrobest DNA polymerase、dNTP Mixture、Recombinant DNase I（RNase-free）、DL5000 DNA Maker、DL2000 DNA Maker 购自 TaKaRa 公司；2EasyTag PCR SuperMix 购自北京 TransGen 生物技术有限公司；Trgptone（OXOID, England）、 yeast extract（OXOID, England）、 维生素B1（Sigma）、 X-gal（Sigma）、IPTG（Merck）；其他所需药品均为国产分析纯。1.1.3 试剂盒 Total RNA 提取试剂盒、PCR Purification 及 Gel Extraction 试剂盒购自 QiaGen 公司；1st Strand cDNA 合成试剂盒、DNA A-Tailing 试剂盒均购自 TaKaRa 公司；质粒小提试剂盒（离心柱型）购自 TianGen 生物技术有限公司。1.1.4 菌株及质粒E. coli 转化所用菌株为 DH5 型， 感受态细胞购自 TianGen 生物技术有限公司；所用质粒为 pGEM-T Easy 型克隆载体，购自 Promega 公司。1.2 方法1.2.1 培养基及试剂配制（1） PDA 液体培养基（1 L） 马铃薯浸取液 1.0 L（取去皮马铃薯200 g， 切成小块， 加水1.0 L煮沸30 min， 滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0 L） 葡萄糖 20 g KH2PO4 3.0 g MgSO47H2O 1.5 g 维生素B1 微量调节 PH 至 6.0；将培养基分装至 100 mL 玻璃三角瓶， 每瓶 40 mL；121 高压蒸汽灭菌15 min。（2） PDA 固体培养基 在 PDA 液体培养基的基础上，每 L 培养基加琼脂15.0 g；121 高压蒸汽灭菌15 min。在超净工作台内将培养基分装至玻璃平皿中，封口后倒置于4 保存备用。（3） LB 液体培养基( 1 L ) Trgptone 10 g Yeast Extract 5 g Nacl 10 g 将 PH 调节至 7.2 7.5 ，121 高压蒸汽灭菌灭菌 15 min 。置于 4 保存备用。（4） LB 固体培养基（+Amp） 在 LB 液体培养基的基础上，加入 1.5% 的琼脂，即每 L 培养基加琼脂 15 g ；121 高压蒸汽灭菌15 min。 待培养基冷却至 50 左右时，在超净工作台内加入 Amp 母液使终浓度为100 g/ml，充分混匀后将培养基分装至玻璃平皿中，封口后倒置于4 保存备用。1.2.2 菌种培养1） 取含有灵芝单倍体菌丝的固体培养基2 - 3 块接于液体培养基中，28、160 rpm摇床培养3 - 4 天，转移至250 ml 培养瓶（含有100 ml液体培养基）继续培养7天，收取菌丝。2） 使用四层纱布过滤，真空抽滤器抽滤灵芝菌丝培养液，并用灭菌超纯水清洗3次，然后将水分挤干，铝箔纸包好后立即置于液氮中速冻。放置在- 80 冰箱中保存备用。1.2.3 灵芝菌丝RNA提取使用 QiaGen RNeasy Mini 试剂盒，操作步骤如下：（1） 液氮研磨，取 50 - 100 mg 粉末放入 2 ml 预冷的 EP 管中。（2） 加入 450 l Buffer RLT (加 1% 的 -巯基乙醇，56，预热 1-3 min)。（3） 将样品转到 Qiashredder Spin Column 上，最大转速离心 2 min，取上清到新的 EP 管中。（4） 加入0.5 倍体积的无水乙醇，并混匀。（5） 将样品转移到 RNeasy Spin Column 上（每次 650 l ），8000g（10000rpm）离心15 s，弃掉废液。（6） 加入 700 l Buffer RW1，离心15 s，弃废液。（7） 加入 500 l Buffer RPE，8000 g 离心15 s，弃掉废液。（8） 加入 500 l Buffer RPE，8000 g 离心2 min，弃掉废液。（9） 将RNeasy Spin Column 放到新的收集管中，最大转速离心1min。（10） 将RNeasy Spin Column 放到新的 1.5 ml 的 EP 中，加入 30 l RNase-free ddH2O，室温放置 2 min ，12000 rpm 离心 1 min。（11） 取 2 l 做琼脂糖凝胶电泳检测，并测定浓度。1.2.4 除去RNA中的基因组DNA（1） 在微量离心管中配制下列反应液，全量50 l。试剂使用量Total RNA 2050 g10DNase I Buffer 5.0 lRecombinant DNase I（RNase-free , 5 U/l）2.0 lRNase Inhibitor 20 UnitsDEPC-treated water up to 50 l（2） 37 反应 2030 分钟。（3） Recombinant DNase I 失活（热处理）： 1） 加入2.5 l 0.5 M EDTA，混匀，80 加热处理2 min。 2） 用RNase Free dH2O 定容至 100 l。（4） 加入10 l 3 M 醋酸钠和250 l 冷乙醇，-80 放置 20 min。（5） 4 ，12000 rpm 离心10 min，弃上清。（6） 加入70%冷乙醇洗净，4 C，12000 rpm 离心5 min，弃上清。（7） 沉淀干燥。（8） 用10 l RNase Free dH2O 溶解后，进行Agarose 电泳检验RNA提取质量，同时使用 Nano Drop 测定 A260/A280 及 RNA 的浓度。1.2.5 1st Strand cDNA 合成 使用 TaKaRa PrimeScript 1st Strand cDNA 合成试剂盒，操作步骤如下： （1） 在微量离心管中配制下列混合液。试剂使用量Oligo dT Primer（50 M） 1.0 ldNTP Mixture（10 mM each） 1.0 lTotal RNA8.0 lRNase-free dH2Oup to 10 l（2） 在 PCR 仪上进行下列条件的变性反应： 65 5 min 冰上极冷（3） 在上述微量离心管中配制下列反转录反应液：试剂使用量上述变性后反应液10.0 l5PrimeScript Buffer 4.0 lRNase Inhibitor （40 U/l）0.5 lPrimeScript RTase（200 U/l）1.0 lRNase-free dH2O4.0 l（4） 在 PCR 仪上按下列条件进行反转录反应： 30 10 min 42 60 min 95 5 min（酶失活） -20 保存备用。1.2.6 目的基因的PCR扩增1.2.6.1 引物序列的设计根据已经测得的灵芝全基因组数据，通过进一步的拼接、注释等操作，获得候选细胞色素P450单加氧酶基因cDNA序列（Gene ID:GL22480），使用引物设计软件 Lasergene PrimerSelect 对该基因序列进行分析，在其开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）前后100 bp 以内寻找最适合的引物对，最终确定引物序列为：上游引物：GL22480-F TTGGCGCATCTGGATAAACACAT下游引物：GL22480-R TCCCCGCACAACCTCAGAACATAC 引物由上海生工生物技术有限公司合成，将引物配制成 100 M 母液，使用时稀释5倍，终浓度 20 M。1.2.6.2 PCR反应以灵芝菌丝cDNA为模板进行PCR反应，反应体系（50 l）如下：试剂使用量Pyrobest Tag DNA Polymerase（5 U/l）0.25 l10Pyrpbest Buffer（Mg2+ plus）5.0 ldNTP Mixture（2.5 mM each）4.0 lcDNA 模板（稀释5倍）2.0 GL22480-F（20 M）1.0 lGL22480-R（20 M）1.0 lddH2O36.75 lPCR反应程序如下：94 5 min（94 30 s55 30 s72 2 min） 30 cycles72 10 min4 PCR 反应结束后，取2 l 样品做琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.7 PCR产物回收使用 QiaGen QIAquick PCR Purification 试剂盒，操作步骤如下：（1） 向 PCR 产物中加入 5 倍体积的 Buffer PB，并混匀。（2） 将混合液转移到吸附柱中，吸附柱置于收集管中，离心30-60 s。（3） 倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入0.75 ml Buffer PE，离心30-60 s。 （4） 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中，离心1 min。（5） 将吸附柱放入一个新的1.5 ml EP 管中，向柱子中部加入30 l 无菌超纯水，静置2 min 后，离心收集。（6） 取2 l 样品做琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.8 PCR产物末端+A在微量离心管中配制下列+A反应体系（10 l）：试剂使用量10A Tailing Buffer1.0 ldNTP Mixture0.9 lA-Tailing Enzyme0.1 PCR产物8.0 lddH2Oup to 10 l 72 反应30 min。1.2.9 目的基因与克隆载体连接在微量离心管中配制下列连接反应体系（10 l）：试剂使用量2Rapid Ligation Buffer5.0 lpGEM-T Easy Vector1.0 l+A 反应产物3.0 T4 DNA Ligase1.0 lddH2Oup to 10 l16 连接过夜。1.2.10 E. coli 转化及蓝白斑筛选（1） 从-80 冰箱中取出感受态细胞并使其在冰上融化后，每100 l 感受态细胞加入10 l 连接产物，冰浴30 min。（2） 42 水浴热激90 s，而后快速将离心管转移到冰上，冰浴5 min。（3） 在超净工作台内，每100 l 感受态细胞加入600 l LB 液体培养基（不加Amp），37 、110 rpm 震荡培养1 h。 （4） 在 LB 固体平板（+Amp）上，加入 X - gal 40 l、IPTG 4 l，混匀涂板，37 暗中放置1 h。（5） 向上述处理过的平板上加入150 l 感受态菌液，涂板并做好标记。（6） 倒置平板，于37 温箱中培养过夜，12-16 h 后出现菌落。（7） 菌落平板倒置于 4 保存。1.2.11 菌落 PCR 检测阳性克隆试剂使用量2EasyTag PCR SuperMix5.0 lGL22480-F（20 M）0.2 lGL22480-R（20 M）0.2 ddH2O4.6 l在微量离心管中配制下列 PCR 反应体系（10 l）：在超净工作台内，使用灭菌牙签挑取白色单菌落在 LB 固体平板（+Amp）上划线，同时在上述 PCR 反应体系中搅动 2-3 次，将微量离心管置于 PCR 仪中反应。反应条件与 1.2.6.2 中的 PCR 反应条件一致。PCR 反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。划线平板倒置于37 温箱中培养，菌落长成后于 4 保存。1.2.12 挑选阳性克隆摇菌并测序根据菌落 PCR 结果，挑选 4 个阳性克隆，使用灭菌玻璃管摇菌，每管加 LB 液体培养基（+Amp）2 ml，37 、220 rpm 震荡培养12 h 后送测序。测序单位为北京农业科学院测序中心。2 结果与分析2.1 灵芝菌丝 Total RNA 提取图1 灵芝菌丝Total RNA 提取产物电泳图取 2 l Total RNA 提取产物进行琼脂糖凝胶电泳（1、2、3为3个重复），采用 TaKaRa 公司的DL5000 为分子量标记，结果如图1所示：Total RNA 提取产物分为两条明显的带，分别为18S RNA 与28S RNA；没有明显的拖尾现象，表明 RNA 降解较少。 NanoDrop 分析结果显示：1号重复RNA 浓度为 193.3 ng/l，A260/A280结果为2.15；2号重复RNA 浓度为 825.6 ng/l，A260/A280结果为2.22；1号重复RNA 浓度为 753.2 ng/l，A260/A280结果为2.21。表明RNA 提取质量较好，除1号重复外，浓度均较高，可进行下一步DNA 消化及cDNA 一链的合成。2.2 DNA 消化除去Total RNA 中的基因组DNA图2 DNA 消化产物电泳图经过消化步骤，去除了RNA 中的基因组DNA 杂质后，取2 l 消化产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用 TaKaRa 公司的DL5000 为分子量标记，结果如图2所示：有微弱的拖尾现象产生，然而仍可清晰地看到区别明显的两条带，分别为18S RNA 与28S RNA，表明Total RNA 在消化的过程中并未发生明显的降解，可进行后续cDNA 一链的合成。2.3 目的基因的PCR扩增 图3 目的基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图 取 2 l 目的基因 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用 TaKaRa 公司的DL5000 为分子量标记，结果如图3所示：目的基因 PCR 扩增产物只有单一条带，表明引物具有足够的特异性，且 PCR 条件较为合适；条带大小在 1500 bp 至 2000 bp 之间，较为接近 2000 bp，与预期大小 1673bp 相一致。琼脂糖凝胶电泳结果初步验证了克隆所得细胞色素 P450 单加氧酶基因的正确性，但仍需后续实验作进一步验证。2.4 PCR产物回收图4 PCR 产物回收电泳图取 2 l PCR 回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用 TaKaRa 公司的DL2000 为分子量标记，结果如图4所示：回收产物只有单一条带，且亮度较高，表明回收效率较高；同时其分子量大小在1000 bp 至2000 bp 之间，更接近2000 bp，与 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果一致，表明目的基因在这一步骤并未受到破坏，且被成功回收，可以进行后续实验步骤。2.5 E. coli 转化的蓝白斑筛选图5 E. coli 转化的蓝白斑筛选结果图37 培养过后，用铝箔纸将平板包好在 4 冰箱放置1 h，如图5所示。在图中可清晰的观察到平板上的白色及蓝色菌落（图5），白色菌落为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。蓝白斑筛选结果显示，平板上菌落较为密集，且白色菌落相对蓝色菌落数目较多，表明转化效率较高，有足够的白色单菌落供后续菌落PCR的筛选。2.6 阳性克隆的菌落PCR验证图6 菌落 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图挑取12个白色菌落做菌落 PCR 验证，采用 TaKaRa 公司的DL2000 为分子量标记，结果如图6所示：1号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、10号、11号分别在 1000 bp 至 2000 bp 之间出现单一条带，与目的基因预期大小相一致，为阳性克隆；2号、9号、12号在 1000 bp 至 2000 bp 之间并未出现明显的条带，为假阳性克隆。根据菌落 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果，选取1号、4号、5号、6号克隆摇菌并送至测序公司进行测序。2.7 测序结果测序结果采用 Lasergene SeqMan 软件进行拼接和分析，结果显示：4个克隆共8条序列，经拼接获得一个contig，与细胞色素 P450 单加氧酶基因原始 cDNA序列完全一致（图7），表明已获得细胞色素 P450 单加氧酶基因的正确克隆。图7 测序返回数据的 Lasergene SeqMan 分析进一步的序列比对显示：1号克隆反向测序序列，在第 1106 位、1146 位、1202 位、1212 位、1214 位、1228 位、1234 位等多个位点处发生突变（图8-a）；5号克隆正向测序序列，第 545 位处的 G 突变成了 A （图8-b）；6号克隆正向测序序列，第 266 位处的 G 突变成了 A （图8-c），且正反向测序序列皆在第 722 位至第 764 位处缺失 43 个 basepairs（图8-d）。badc图8 不同克隆测序序列与原始序列的比对根据测序结果及相关分析，发现4号克隆与细胞色素 P450 单加氧酶基因原始 cDNA 序列完全一致，因此，选择4号克隆作为材料，进行后续表达及功能验证等相关实验。3 讨论CYP450 是高等植物中最大的酶蛋白家族，其在灵芝三萜生物合成途径中发挥着举足轻重的作用。本实验中CYP450 原始序列参考自中国医学科学院药用植物研究所陈士林课题组的灵芝全基因组测序及注释项目，该项目利用新一代测序（Next-generation sequencing，NGS）技术454 GS FLX 对灵芝进行全基因组测序、组装，基因预测和注释，发现了所有参与灵芝三萜骨架合成的基因，及197个可能参与灵芝三萜骨架修饰的CYP450 基因，并通过共表达分析和系统进化研究从中筛选出16个基因进行进一步的功能鉴定，本实验所做的克隆为其中之一。考虑到测序过程中可能出现的数据读取错误等情况造成的序列信息与实际情况不符，在引物的设计过程中，特意避开开放阅读框（ORF），在起始密码子与终止密码子前后100 bp 以内进行引物的选择。农科院测序结果返回后，发现四个克隆的最终拼接结果与原始序列完全一致，这表明454 测序结果具有较高的可信度，其测序结果基本可反应该基因的实际情况。然而，四个克隆中有三个克隆在个别碱基处存在差异，目前不能确定这种差异是由于PCR 反应过程中碱基的错配造成，还是由于测序公司测序质量较差导致；此外，其中一个克隆在第722位至第764位处存在43个碱基的缺失，可能是由于该基因存在一定程度的可变剪切造成，但这种可变剪切对CYP450 的功能有何影响仍需后续的表达实验来验证。即便如此，我们仍然能够从四个克隆里挑选出一个与原始序列完全一致的克隆，该克隆可进一步连接酿酒酵母表达载体 pYES2 并转化酵母菌株，进行表达及功能验证，以判断其是否参与灵芝三萜生物合成并对其进行特征描述。参考文献:1 Wachtel-Galor S, Tomlinson B, Benzie IFF. 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