实时荧光定量PCR简介及其在食品监测领域中的应用.doc

实时荧光定量PCR简介及其在食品检测领域中应用摘要：实时荧光定量PCR 是在定性PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术；该技术不仅实现对DNA 模板定量，且具有灵敏度高、特异性强、无污染性、及实时性和准确性等特点。该文主要介绍实时荧光定量PCR 原理和在食品检测中应用，及其在食品领域发展前景。关键字：荧光定量PCR；致病菌检测；转基因食品检测Abstract：Realtime fluorogenic quantitative polymerase Chain Reaction is a quantitative nucleic acids technology based on quanlity PCR，with characteristics of high sensitivity and specificity，pollutionfree，instantaneity and accuracy as well as realization for quantitation of DNA template. its principle and application in food detection have been introduced in this article，and its prospect in food field predicted.Key word：realtime quantitative PCR；pathogen detection；genetically modified food detection1、 实时荧光定量PCR技术原理实时定量荧光PCR技术是从传统 PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量的体系。PCR反应过程产生DNA拷贝数，随反应循环数增加，以呈指数方式增加逐渐转入平台期。在传统PCR中，用终点法对PCR产物定量有不足之处；而在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，加入的荧光物质具有特定的波长，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始 DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT（threshold value）值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。122、 实时荧光定量PCR 类型实时荧光定量PCR 类型主要有探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交探针指示扩增产物增加，特异性高；而非探针类是即实时定量荧光PCR技术最后是通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。利用染料或特殊设计引物指示扩增增加，特异性受到质疑，但其简便易行。近年来，又发展一些新的预防或识别非特异扩增的探针法，例如Amplisensor 技术、分子信标（Molecular beacon）、Lightcycler 技术、复合探针法（Complex probes）等。（1） 实时荧光定量PCR 类型探针类按其基团标记和能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，大体可以分为水解探针和杂交探针两类。TaqMan TM探针(水解探针)、TaqMan MGB (水解探针)、Dual-oligo FRET pairs(双杂交探针)、MolecularBeacons (杂交探针)、ScorpionsTM/AmplifluorTM (杂交探针)、Universal probe library-LNA ( locked nucleic acids水解探针)、LUX (杂交探针)、Simple probe探针等3，具体见图1。A. DNA结合染料B.杂交探针C.水解探针D.分子信标E.蝎状引物F.发卡式引物G. lightupon extention杂交探针图1.各种探针工作原理1）水解探针TaqManTM及TaqMan系列探针TaqManTM探针的长度为2024 bp，在其5末端标记一个荧光报告基团， 3末端标记一个荧光淬灭基团，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。较之常规探针，TaqMan 探针能被 DNA合成酶（例如Taq酶）的 53 活性所降解，而且其探针的 5 端有一荧光报告基团，3端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，会发生能量传递作用，从而使报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行。接着 5 端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。其工作原理如图2所示。TaqManMGB探针是在TaqMan探针的基础上改进的，长度可缩短到13bp，在探针的3端增加了MGB (minor groove binder)分子，能够结合双链DNA小沟部位，配对更容易，且节约了成本；MGB提高了探针的Tm值，能够分辨1个碱基的差别(完全配对才有荧光信号)；连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团，这种探针淬灭效果更好、无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比等优点。TaqMan-分子信标(TaqMan-MB)是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种均相荧光检测探针，该探针保留了分子信标的茎环结构，有效解决了背景荧光的问题，不同在于除环部序列外，其5端的臂序列有基因识别位点4。当进行PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步1。 优点是：特异性高；设计相对分子信标简单；定量准确。缺点是：成本高；只用于一个特定目标基因。常用的荧光基团是FAM、TET、HEX2，见表1。图2.TaqMan 探针工作原理表1.常用荧光基团2）水解探针Universal probe library-LNA探针Universal probe library-LNA ( locked nucleic acids)是一种双RNA聚合的类似物，其2-O，4-C形成亚甲基的桥键，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和优越的稳定性。在5端和3端分别标记上荧光报告基团与荧光淬灭基团，单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的Tm值，其稳定性比PNA高( PNAS2000，97: 56332 5638)因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性，故这种探针稳定性最好；而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解探针特点2。3）cycling探针是一种由DNA、RNA构成的杂合探针，与RNaseH组合使用，内部含有RNA碱基， 5端和3端分别标记荧光物质与淬灭物质。探针完整时，荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中的互补序列杂交，RNaseH切断探针的RNA部分，淬灭作用解除，荧光物质发出荧光5。4）杂交探针分子信标（molecular beacon）分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。由于黑色淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图3）。荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，也与被扩增的模板量相对应，从而实现了对目的基因的定量检测6。该方法优点是灵敏度高、特异性强、荧光背景低，其缺点是设计要求高、杂交探针不能完全与模板结合、稳定性较差、探针合成的时候标记较复杂。常用的荧光基团有FAM和Texas Red。图3.分子信标工作原理5）荧光标记引物荧光引物法是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它是把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有Amplifluor， Sunrise，Amplisensor， Scorpion，LUX( light upon extention)等。例如：LUX Primers LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（如图 4 ）。图4.LUX工作原理6）复合探针法该法结合了分子信标和LightCycler两种技术的优点，为使用非荧光淬灭剂，本底低，对扩增效率影响小，探针设计、合成、标记、纯化方便，是我国研究和开发的一种新型定量PCR技术。该技术的特点是先合成荧光探针后合成淬灭探针，荧光探针(25 bp)5端标以荧光报告基团，而淬灭探针(15bp) 3端标以荧光淬灭基团，淬灭探针能与荧光探针5端杂交，吸收荧光信号6。当反应中无模板时，两探针结合形成复合探针，荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收，无荧光产生；当反应溶液中有模板时，在PCR复性阶段荧光探针优先与模板结合，两探针分离，产生荧光，其强度与PCR体系中模板数量成正比，可进行PCR定量7。7）双杂交探针双杂交探针(Dual-oligo FRET pairs)又称为FRET探针或者LightCycle探针，采用两条相邻(距离15bp)、与模版互补的特异探针和一对序列特异性引物。第一个探针3端带有荧光供体，第二个探针的5端带有荧光受体。在3端用荧光激发供体基团，在毗邻探针5端受体基团处实施荧光信号监测。在PCR反应变性后退火，探针头尾相连地杂交在靶标序列上，因此两基团靠近，从供体到受体产生FRET发出荧光，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例7,5。检测时只检测受体基团发出的荧光；变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到荧光。该方法淬灭效率高，两条探针均与目的基因特异性结合才能检测到受体基团发出的荧光，检测的特异性增加。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析4。但两个探针结合于模板上影响扩增效率，合成两个探针，成本相对较高。常用的荧光基团: LC-Red640和LC-Red7058。8）其他探针Simple探针和神标荧光探针。Simple探针只在5端标有报告荧光，在报告荧光和5端之间连接一种“linker”结构，当在高温条件下，“linker”结构改变，释放荧光。这种探针的优点是不用淬灭基团，无背景荧光。神标荧光探针是AlleLogic公司新发明的一种荧光探针。该探针操作简单、成本低，效果比常规TaqMan探针增加60%，试验设备无需更换。它不需要荧光淬灭基团，是在单一链DNA序列上多重标记恰当的、易处理的荧光染料9。（2） 实时荧光定量PCR 类型非探针类双链DNA (dsDNA)结合染料SYBR Green检测目前用于实时PCR的主要dsDNA结合染料SYBR Green I是一种非饱和菁类荧光素，能结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm 。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。其工作原理如图5所示。SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I 与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I 得到定量结果。10优点是：使用方便，不需要复杂的序列设计；成本低；无序列特异性。缺点是：特异性差；灵敏度低；不可以做多种检测。图5.SYBR GREEN I 工作原理三、实时荧光定量PCR优缺点实时PCR技术利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中的每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析，对起始模版进行定量分析。比起普通 PCR，由于RT-PCR具有引物和探针的双重特异性，因此，与传统PCR相比，特异性大为提高；该技术敏感度通常高达102copy/ml且线性范围很广，为01011copy/ml(临床医学标本中病原体的数目一般为01010copy/ml)；该技术稳定性较强(同一标本的CT值相近甚至相同)精密度高，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，批内及批间差小8；该技术操作简单、自动化程度高；封闭环境，无后处理，不用杂交，不用进行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，人工分析数据等步聚，更为简便、快速高效，且具有很高的敏感性和特异性，能降低污染，还可以进行多重扩增。和所有刚出现的技术一样，RT-PCR 在作为标准技术应用之前仍存在许多问题： 参照物的选择：在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于没有统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性； 探针制备的成本和新的荧光染料的开发； 分析灵敏度的进一步提高及重复性问题11； 自动化仪器和试剂成本较高； 样品处理制备及多基因同时分析等。随越来越多目的基因被导入更多食品作物中及越来越多转基因生物采用全新启动子、终止子和标记基因，因而再用荧光定量PCR 检测常用筛选因子就会有一定局限性。若将该技术与其它诸如生物芯片、免疫磁珠、色谱技术、光谱技术等联合使用，必将在食品安全检测领域开辟一个新的应用时代。随着 RT-PCR技术与生物芯片技术、肽核酸技术，荧光探针定量技术等先进技术的整合，RT-PCR 应用前景将越来越广阔。同时 RT-PCR 技术将会在转基因检测中发挥不可替代的作用12。4、 实时荧光定量PCR的应用RT-PCR技术基于其特异性好，准确性高，假阳性低；灵敏度高，可定量检测，误差小；操作简单，自动化程度高，产物的扩增和检测闭管一步完成，交叉污染和污染环境机会少；无后处理，不需杂交、电泳、拍照等特点已被广泛应用于基础科学研究、临床疾病诊断、食品安全、疾病研究及药物开发等领域。在科研方面可定量分析各种基因的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态SNP测定及易位基因的检测；在医疗方面可用于免疫组化分析、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析、肿瘤微小残留病变研究等。此外，RT-PCR技术在动物检疫和环境监测13等方面也得到了广泛的应用，使人们的健康得到保障，同时，也可使人们深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过。荧光定量PCR 在食品领域应用实时荧光PCR 技术能有效解决传统定量中只能终点检测局限，同时由于采用闭管分析，且无需电泳等PCR 后处理步骤，所以能有效减少核酸扩增产物交叉污染，更避免电泳染色剂EB 或用于标记目的产物放射性同位素对研究人员伤害。因此将实时荧光定量PCR技术应用到食品致病菌检测，既克服传统致病菌检测方法在快速、敏感与特异性等方面局限，又大大缩短检测时间、提高检测灵敏性和特异性，为今后提高食品微生物检验时效性提供很大发展空间。转基因食品是近20 年随基因工程技术发展而产生新兴食品，近年发展更为迅速，已走进寻常百姓餐桌，因此其安全性问题也成为公众注意焦点。一种敏感、快速、准确转基因食品定性及定量检测方法已成为需亟待解决问题，而荧光定量PCR 技术迅速发展及其应用推广已基本上解决这一难题。（1）致病菌检测食品中致病菌传统检测方法是先采用非选择性和选择性增菌，然后进行分离培养、生化反应和血清学鉴定，检验程序十分繁琐；且肠杆菌科细菌间生化反应多有交叉，一般需4 d7 d 才能完成，因此传统检测方法在快速、敏感与特异性等方面都有自身局限性14。随着分子生物学及分子细菌学发展，荧光定量PCR 技术应用为致病菌检测提供一种新的手段1517。1）沙门氏菌检测沙门氏菌所引起中毒在世界各地食物中毒病例所占比例非常高。有资料显示，我国70%80% 细菌性食物中毒事件系由沙门氏菌引起18。目前正在进行食品质量安全监控的中国计量认证（China metrology accreditation，CMA）检测时，对沙门氏菌检测已成为必检卫生指标之一19。近年来PCR 技术用于检测食品中沙门氏菌方法有多种，如常规PCR、套式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等，这些方法各具其优缺点，其中荧光定量PCR 因其不易污染、灵敏度高等优点，将会越来越广泛应用到食品沙门氏菌检测。Daum 等20建立利用荧光定量PCR 法从引起沙门氏菌食物中毒剩菜及病人粪便中检测沙门氏菌方法，且利用荧光TaqMan PCR 法在3小时内即可从鸡肉中检测出沙门氏菌，更证明荧光定量检测时效性。2）副溶血性弧菌检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）主要分布于海水、海河交界处及海产品中，是沿海地区引起食物中毒重要病原菌。副溶血性弧菌在海产品中带菌率高达45.7%21，其生长速度是一般细菌（如大肠杆菌、沙门氏菌等）两倍，因而更易于引起食物中毒。目前，对副溶血性弧菌检测仍以传统培养法为主，实验操作繁琐，一般需费时5 d6 d，因此影响食物中毒快速诊断和处理；且其检出率较低，给海产品生产、出入境检验检疫及食品卫生监督等带来困难。近年用PCR 技术快速检测食品中副溶血弧菌文献也多有报道2224；但常规PCR 有一定缺陷，例如扩增产物易受污染、出现假阳性结果等。为克服这些缺陷，焦红等建立用荧光定量PCR 检测食品中副溶血弧菌方法。研究表明，该法具有良好特异性和灵敏度，与传统检测法相比，大大提高检测效率；且操作简便快速、检验周期短，所以其在食品副溶血弧菌检测中将有很好应用前景。3）霍乱弧菌检测霍乱弧菌检测一直是微生物检验工作一个难点，尤其是食品中霍乱弧菌检测，常常由于菌量少、菌株变异大及霍乱弧菌越冬机制不明瞭，使常规培养法、血清学检测法等无法检出。张世英等在研究霍乱弧菌不同血清型NhaA 基因变异基础上，选取不同血清型间NhaA 基因共有保守序列，建立荧光定量PCR检测方法，并比较其与常规检测方法在海产品霍乱弧菌检测上灵敏度和特异性。结果表明，荧光定量PCR与常规检测方法灵敏度、特异性一致；但在含菌量少、菌株易发生变异标本检测上，荧光定量PCR 显示出其独特优越性。因其不仅提高常规检测方法灵敏度，且避免常规PCR 方法由于后处理过程引起污染所带来假阳性，对食品，尤其是海产品霍乱弧菌检测有较大指导意义。4）其它致病菌检测除上述病原微生物检测外，RTPCR 技术还用于食品中其它多种致病菌检测。Fu等研究发现，将免疫磁珠法与实时荧光定量PCR 技术相结合，即可不经富集培养阶段便可准确、快速检测出大肠埃希氏菌O157：H7；Rueckert 等利用特异性16S rRNA 引物部分基因片段定量检测出奶粉中嗜热细菌；Berrada等用定量PCR 检测出色拉中利斯特菌；张霞等21建立奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR 检验方法；金大智等建立食品中单增李氏菌实时荧光PCR检测鉴定方法。此外，还有将该技术应用到食品致病性蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等检测报道。25（2）食品转基因检测当前，国际社会对转基因食品检测技术路线主要有两条：一是对外源基因表达产物蛋白质进行检测；二是直接检测外源基因DNA。随检测手段不断提高，对食品转基因检测已从定性提高到定量水平。对外源基因表达产物蛋白质检测常用方法有酶联免疫法（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blot）等，这些检测方法大多基于免疫反应高度特异性。外源基因DNA 检测主要是以核酸为基础PCR检测法，用PCR 技术和核酸探针杂交检测技术准确快速检测外源基因，其敏感、快速、简便特点是其它检测技术所无法比拟的。而新近发展实时荧光定量PCR技术是集PCR和探针杂交技术优点为一体，可通过探测PCR 过程中荧光信号变化，准确定量DNA 模板量。其检测灵敏度比常规PCR技术高100倍左右，可检测到每克样品中含2 pg 转基因DNA 量；且对加工、未加工和混合样品都可进行检测。RQ-PCR 的一系列优点使其在转基因产品的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中被广泛的应用。近年有许多利用RTPCR 技术检测转基因食品文献报道，陈颖等采用实时荧光定量PCR 技术，通过使用特异引物和探针，对玉米中内源基因lnvertase、转基因玉米Mon810、Event 176外源基因进行定量检测，由此建立商业化转基因玉米Mon 810（YieldGard）和Event 176（Maximizer）定量PCR 检测方法。该法检测灵敏度可达0.01%，是国际上设定转基因最低限量100 倍。Hagen 等研究表明，荧光定量PCR法可检测出包括豆腐等在内豆制品中转基因成份含量；邓鸿铃等针对食用油脂中DNA 含量极低、DNA 序列片段短、破坏严重等特点，建立食用油脂DNA 提取方法，通过实时荧光PCR 检测出大豆内源基因（Lectin）及外源抗除草剂基因，为食用油脂进行核酸类生物性检测提供一种快捷有效方法26。也就是说RT-PCR可以确定是否为转基因产品的定性检测、转基因产品品系的鉴定、转基因产品含量的检测。参考文献1 李文涛,王俊东,杨利峰,等.实时荧光定量PCR技术及其应用J.生物技术通讯, 2006, 17(1): 112114.2 赵焕英,包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展 J.中国组织化学与细胞化学杂志.2007, 16(4): 9093.3 Marisa L, Wong and Juan F. 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