苦瓜类胡萝卜素含量和八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素脱氢酶基因的表达.doc

苦瓜类胡萝卜素含量和八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素脱氢酶基因的表达摘要苦瓜作为一种热带作物，其果实中包含的b-胡萝卜素含量是胡萝卜的5倍。为了研究苦瓜中类胡萝卜素聚集的机制，检测了八氢番茄红素合酶(McPSY)和八氢番茄红素脱氢酶(McPDS)基因的表达水平。这些基因的表达量在苦瓜花中很高，在水果成熟过程中，八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素脱氢酶基因的表达量在中期有所下降，但在全熟期又有所增加。此外，果皮中的类胡萝卜素在从绿变黄的过程中不断积累，因此，八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素脱氢酶基因的表达量在果实成熟过程中与类胡萝卜素的积累相关。主成分分析法（PCA）也用于评估类胡萝卜素在果实的七个成熟阶段的含量关系。成熟的果实比未成熟的果实类胡萝卜素含量更高。1. 前言苦瓜属于葫芦科，是一种种植在热带和亚热带的药用作物。因为包括果实在内的整个植株都很苦，故被称为苦瓜或苦葫芦。(Grover & Yadav, 2004; Gurbuz, Akyuz, Yesilada, & Sener,2000)。在传统医学中，苦瓜用于治疗糖尿病，近年来科学研究表明苦瓜是一种很有前途的糖尿病治疗药物(Leung, Birtwhistle,Kotecha, Hannah, & Cuthbertson, 2009; Nahas & Moher, 2009;Platel & Srinivasan, 1997)。此外，苦瓜还有其他的诸如抗癌(Nerurkar &Ray, 2010)，杀菌(Mahomoodally, Gurib-Fakim, & Subratty,2010)，排除肝毒素(Chang et al., 2010)，抗氧化(Kumaret al., 2010)，抗病毒(Lee-Huang et al., 1995)，抗溃疡(Gurbuz et al., 2000)，和抗寄生虫(Prabakar & Jebanesan, 2004)等功效。苦瓜的果实、种子乃至整个植株中都含有很多主要和次要代谢产物，特别是，未成熟的苦瓜中含有大量的类胡萝卜素(Raman & Lau, 1996; Zhang, Hettiarachchy, Horax, Chen, & Over,2009)。类胡萝卜素是一类在叶、花和果实中积累的，包含有超过600种自然产生红色、橙色和黄色的色素(Sergio & Robert, 1999)，这些色素在植物生理过程中起重要作用。例如，它们在光合作用膜中作为一种光的受体，可以防止光造成的损伤(Bartley & Scolnik, 1995; Peuelas & Munn-Bosch, 2005)，此外，在花和果实中，类胡萝卜素的颜色可以吸引动物以传粉和传播种子(Howitt & Pogson, 2006)，另外，类胡萝卜素是植物激素的前体，如调控发育和压力的脱落酸(Koornneet,1986)。在人上，一些类胡萝卜素是重要的营养物质，有些有显著的抗病效果。例如，类胡萝卜素A类，包括a-类胡萝卜素和b-类胡萝卜素，是可以防止眼干、失明和早产儿死亡的维生素A的前体(IMFNB, 2000;Mayne, 1996)，此外，其他类胡萝卜素的吸收也会显著降低肺癌(Holick et al., 2002)、前列腺癌(Giovannucci, 1999)、心血管疾病、白内障和光敏性疾病(Botella-Pav & Rodrguez-Concepci, 2006; Kritchevsky, 1999)的发生。 类胡萝卜素的生物合成通路已经被广泛研究，合成途径的第一步(图1)是八氢番茄红素合成酶(PSY)催化两个牻牛儿牻牛儿二磷酸(GGDP)的聚合，形成一个C40八氢番茄红素，然后，两个脱氢酶，八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和n-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)将4个双键还原，形成番茄红素，接下来，这个通路分成两支，其一是将番茄红素加上一个e-环和一个b-环，形成一个a-胡萝卜素，用来合成叶黄素，另一支，则是在番茄红素上加了两个b-环，以合成玉米黄素、百合黄素和堇黄素。编码所有在类胡萝卜素生物合成过程中的酶的基因已经在不同的植物中被克隆和进行了特征测定(Castillo, Fernandez, & Gomez-Gomez, 2005; Clotaultet al., 2008; Guo, Yang, Hu, & Yang, 2009; Ha, Kim, Park, Lee, &Cho, 2007; Kato et al., 2004; Kita et al., 2007; Pogson, McDonald,Truong, Britton, & DellaPenna, 1996; Ronen, Cohen, Zamir, & Hirschberg,1999)。特别是，PSY和PDS在控制类胡萝卜素生物合成中对合成速率的控制起重要作用，例如，在番茄果实成熟过程中，PSY和PDS的过量表达与番茄素的积累(Bramley,2002; Cunningham, 2002)和类胡萝卜素的总量密切相关(Fraseret al., 2002)，相反，在拟南芥中对PDS的破坏会降低类胡萝卜素的合成量(Qin et al., 2007)。 本研究中，苦瓜的果实成熟过程中在不同器官和不同阶段中探究了类胡萝卜素积累和PSY、PDS基因的表达量的关系，另外，运用主成分分析法评估了在果实成熟的七个不同阶段的的含量关系图1.植物中类胡萝卜素合成通路，PSY，八氢番茄红素合酶； PDS，八氢番茄红素脱氢酶；GGDP, 牻牛儿牻牛儿二磷酸。（没错，就是这个名）2. 材料与方法2.1. 植物材料苦瓜种子购买于亚洲种子公司（韩国首尔），储存在4摄氏度，苦瓜种子在温室中孵育发芽，然后被转移到韩国Daejeon 的Chungnam National University的试验田中，五个月后，6个阶段的果实都被采收下来（图2，补表S1），根、茎、叶、花和果实被收集并储存在-80摄氏度。2.2. 苦瓜八氢番茄红素合酶基因和八氢番茄红素脱氢酶基因的RT-PCR方法使用植物RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN, Valencia, CA)从苦瓜不同器官中提取总RNA，然后用ReverTra Ace-a- kit试剂盒(Toyobo,Osaka, Japan)反转录成CDNA，使用Primer3软件(/primer3)根据苦瓜PSY(GenBank 序列号 AY494789)和PDS(GenBank 序列号AY494790)的CDNA序列设计定量RT-PCR的引物（补表S2）。苦瓜环孢素受体基因(GenBank 序列号HQ171897)是一个管家基因，作为内参。各基因的表达量用各基因与管家基因的拷贝数即RQ（相关表达量）显示，RT-PCR在一个Mini Opticon RT PCR 系统(BioRad, Hercules,CA)中进行，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix 试剂盒 (Toyobo)在如下条件下进行扩增：94摄氏度5分钟，随后是94摄氏度15秒、56摄氏度15秒、72摄氏度20秒的循环40个，每个实验进行三次，实验条件与先前描述相同(Tuan et al., 2010)。2.3. 苦瓜类胡萝卜素的提取和高效液相色谱分析苦瓜样本(0.1 g)中的类胡萝卜素萃取后溶于3ml含0.1%抗坏血酸(w/v)的乙醇中，混合物漩涡震荡20秒，在85摄氏度水浴中孵育5分钟。接下来加入120l氢氧化钾(80% w/v)以皂化可能会有的油脂，漩涡震荡并在85摄氏度孵育10分钟后，样本置于冰上，加入1.5ml冷的去离子水和0.05ml b-Apo-80-胡萝卜醛 (12.5 g/ml)。然后，类胡萝卜素被1.5ml己烷提取两次，每次在1200g离心以分层，接下来提取物在氮气流下冻干，并悬浮于50:50 (v/v)的二氯甲烷/甲醇混合液中，分析类胡萝卜素的提取法与之前所述的相同(Howe & Tanumihardjo, 2006)。进行高效液相色谱(HPLC)之前，胡萝卜素在Agilent 1100 HPLC系统中用C30 YMC 分离柱 (250 X4.6 mm, 3 m; Waters Corporation,Milford, MA)分离，并用光敏二极管阵列在450nm检测。溶剂A包括甲醇/水 (92:8 v/v)和10mM乙的酸铵，溶剂B包括100%的甲基三丁基乙醚(MTBE)，流动速率为1ml/min，样品以以下顺序洗脱：0 min, 83% A/17% B; 23 min, 70% A/30% B; 29 min, 59% A/41% B;35 min, 30% A/70% B; 40 min, 30% A/70% B; 44 min, 83% A/17% B;and 55 min, 83% A/17% B。类胡萝卜素的识别和峰值分配主要基于他们保留的时间的对比和紫外-可见光光谱数值与标准值的关系，在先前所描述的顺序下显示(Fraser, Pinto, Holloway, &Bramley, 2000; Howe & Tanumihardjo, 2006)。2.4. 主成分分析苦瓜果实不同成熟阶段的类胡萝卜素含量主成分分析使用不进行预处理的SAS9.1软件包(SAS Institute, Cary, NC)，主成分使用相关系列矩阵进行检测，主成分的数值使用其本征值进行标定，最后，数据使用绘制的主成分值和载荷进行显性化，所显示的数据指示了结果中每种类胡萝卜素的分布情况。（没弄懂）2.5. 统计分析每个实验结果均取三次实验所得出数据的平均值，实验结果的显著程度使用标准差进行评估。3. 结果与讨论3.1. 苦瓜不同器官的八氢番茄红素合酶(PSY)和八氢番茄红素脱氢酶(PDS) 基因的表达量 PSY (McPSY)和PDS(McPDS)在苦瓜花中的表达量比其他器官中高，尽管McPDS 在新叶中的转录量几乎与花中一样多，此外，在苦瓜中McPSY的表达率在雄花中比雌花中更高。然而，McPDS在雌花中的表达率比雄花中高(图. 2A 和 B)。McPSY 和McPDS在根、茎和新叶中的表达量适中，在老叶中表达量最少。在植物中，类胡萝卜素的含量在绿色组织中是稳定的，而在其他组织中却有所不同。例如，绝大部分植物的叶中包含大量光合作用必需的叶黄素、堇黄素和b-胡萝卜素(Yamamizo, Kishimoto,& Ohmiya, 2009)。在本研究中，苦瓜老叶和新叶中都富含光合作用类型的类胡萝卜素。然而，McPSY 和McPDS在叶中的表达量则偏低。因此，苦瓜可能使用其他的酶或McPSY 和 McPDS的其他亚型来合成类胡萝卜素，在番茄中也有类似的情况，即PSY有两种功能不同的亚型：PSY-1负责有色体中的类胡萝卜素结构，而PSY-2则与叶绿体光合作用通路有关(Fraser, Kiano, Truesdale,Schuch, & Bramley, 1999)。然而，苦瓜也中类胡萝卜素光合作用的机制还需进一步研究以澄清。图2. 苦瓜成熟阶段不同器官的八氢番茄红素合酶(PSY)和八氢番茄红素脱氢酶(PDS) 基因的表达量。(A, B)不同器官中PSY和PDS的表达量；(C)苦瓜果实6个不同阶段的照片，阶段按照苦瓜的大小来进行区分 (图. S2)；(D和E) 果实成熟过程中PSY和PDS的表达量，每个柱状图的高度和误差棒分别显示了三次独立实验的均值和标准误，O-leaves, 老叶; Yleaves,新叶; M-flowers, 雄花; F-flowers, 雌花; CYP, 苦瓜环孢素受体，每一个柱状图的高度显示了三个实验结果的均值，误差棒显示了标准差。图3.苦瓜成熟过程中类胡萝卜素两种主要组成成分含量的主成分分析结果（A）和柱状图(B)，（？）3.2.苦瓜成熟过程中的PSY和 PDS 基因表达量苦瓜果实6个成熟阶段的McPSY和McPDS表达水平相似（图. 2C)，特殊的是，表达量最初有所下降，后来随果实变为橙色则明显增长(图. 2D和 E)，例如，McPSY的表达量从第一阶段(RQ = 1.16)到第二阶段(RQ = 0.62)有所下降，而第三阶段(RQ = 0.88)到第六阶段(RQ = 3.47)却增加了5.5倍，同样的，McPDS的表达量有第一阶段(RQ = 0.97)到第四阶段(RQ = 0.31)下降了三倍，而第六阶段(RQ = 0.94)却恢复了。3.3. 苦瓜成熟过程中类胡萝卜素含量的主成分分析（这一段有几个词翻译的不对）主成分分析结果显示两个主成分的本征值都大于1.0，并且占总差异值超过96%。第一个主成分（PC1）占总差异值的56.2%，决定了成熟阶段的早期和晚期，特殊的是，第六个阶段的胡萝卜素水平与其他阶段有所不同(图. 3A)，第二个主成分(PC2)占总差异值的40.6%，只决定成熟阶段的早期，为了确定主成分的功能，比较了PC1和PC2的负荷，对于PC1来说，负荷对于百合黄素、b-胡萝卜素、b-玉米黄素和玉米黄素为正，而对-胡萝卜素、叶黄素、和堇黄素为负。结果显示，差异主要归因于百合黄素、b-玉米黄素和玉米黄素，其本征值分别为0.4961、0.4913和 0.4512 (图3B)。对于PC2，负荷对于所有类胡萝卜素均为正，结果显示第六阶段百合黄素、b-胡萝卜素、b-玉米黄素和玉米黄素的量高于其他阶段。主成分分析是一种普遍的用于识别多变量化学系统中其决定性差异作用的化学计量工具(Kim, Bamba, Harada, Fukusaki, & Kobayashi,2007)，在本研究中，主成分分析用来确定在苦瓜果实成熟过程中引起类胡萝卜素水平差异的最主要类胡萝卜素。分析结果显示样本之间的差异很小，这说明该实验系统是稳定并且可重复的。主成分值和负荷表明了在苦瓜果实成熟的早期和晚期阶段类胡萝卜素成分的不同。图. 4. 苦瓜成熟过程中PSY和PDS表达量和类胡萝卜素的积累。数据点和误差棒状曲线从3个独立的测量结果分别显示了均值和标准误，S1, 阶段 1; S2, 阶段2; S3, 阶段3; S4, 阶段4; S5, 阶段5; S6, 阶段6. 每个棒状曲线显示了三个测量结果的平均值，误差棒状曲线显示了标准差。表 1：苦瓜不同器官中的类胡萝卜素含量 (g/g 干重). 结果用均值表示 (SE) (n = 3). N.D，未发现；O-leaves, 老叶; Yleaves,新叶; M-flowers, 雄花; F-flowers, 雌花;根茎老叶新叶雄花雌花番茄红素N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.-胡萝卜素0.6(0.2)3.3 (0.2)23.2 (2.4)10.2 (0.8)7.0 (2.0)7.8 (0.6)叶黄素10.4 (5.3)111 (5.3)284 (91.8)224 (49.2)98.1 (7.1)120 (21.7)b-胡萝卜素23.5 (13.4)262 (8.8)744 (272.5)634 (192.7)395 (8.6)356 (34.6)b-类胡萝卜素0.6 (0.3)1.0 (0.2)3.5 (0.3)3.5 (0.8)6.7 (0.9)7.6 (0.4)玉米黄素0.0 (0.0)0.1 (0.0)0.5 (0.0)0.6 (0.1)0.3 (0.0)0.3 (0.0)百合黄素0.4 (0.1)2.9 (0.2)7.5 (0.4)9.2 (1.3)15.1 (0.5)5.3 (0.4)堇黄素0.9 (0.3)8.5 (0.7)40.3 (3.0)29.6 (4.5)45.1 (1.9)14.8 (0.5)3.4. 苦瓜类胡萝卜素的高效液相色谱分析苦瓜不同器官中的类胡萝卜素含量不同（表1），根的类胡萝卜素含量最低，实际上，番茄红素和百合黄素在根中几乎没有检测到，根中最丰富的类胡萝卜素是b-胡萝卜素(23.5 g/g)，然而这个水平却比植物其他任何部位都低。光合作用必须的叶黄素、堇黄素和b-胡萝卜素在叶，尤其是老叶中含量丰富，特别是，叶黄素、堇黄素和b-胡萝卜素在老叶中的含量分别为284.3g/g、40.3g/g和743.8g/g，和新叶的223.9g/g、29.6g/g和634.2g/g相比更高、在叶中没有发现其他的含量在和检测值中的类胡萝卜素。在雌花中，e,b-类胡萝卜素，即叶黄素和a-胡萝卜素都比b,b-类胡萝卜素的含量高，然而，在雄花中，b,b-类胡萝卜素，也就是b-胡萝卜素、百合黄素和堇黄素的含量高于叶黄素。在茎中，最丰富的类胡萝卜素是b-胡萝卜素(262.4g/g)，苦瓜果实中类胡萝卜素的含量在其果实由绿转橙过程中亦有变化（补图S1），例如，在阶段一中的叶黄素和a-胡萝卜素比更成熟的时期更加丰富（补表S3），此外，从阶段一(14.6g/g)到阶段四(4.5g/g)，a-胡萝卜素的含量有所下降，接下来在阶段五(8g/g)略有上升，在阶段六(4.5g/g)又下降。尽管在所有阶段叶黄素都比a-胡萝卜素含量丰富，它们的含量却符合相同的模式，相反，玉米黄素和b-玉米黄素则在果实的早期和中期相比成熟期较低。类似的，番茄红素，一种红色的类胡萝卜素，只在最后果肉开始变红的阶段有所积累。此外，所有在类胡萝卜素光合作用通路上b,b-类胡萝卜素分支的五个成员，即b-胡萝卜素、b-玉米黄素、玉米黄素、百合黄素和堇黄素都有类似的积累模式，然而，b-胡萝卜素和堇黄素的含量却在阶段一和阶段六之间有所下降，例如，b-胡萝卜素含量在阶段一是274.5g/g，第四阶段降低至73.2g/g，而第六阶段则增长至332.4g/g。因为成熟的苦瓜果实富含作为维生素A前体的b-胡萝卜素，故它可以降低中风、心脏病和癌症的发病率(Botella-Pav & Rodrguez-Concepci,2006; Giovannucci, 1999; Kritchevsky, 1999)，苦瓜果实中的b-胡萝卜