Tricine- PAGE凝胶电泳.doc

Tricine- PAGE 一. 实验原理二. 试剂器材试剂配制：分离胶贮存液：Acrylamide 丙烯酰胺48gN,N-methylene-bis-acrylamide 甲叉双丙烯酰胺1.5g双蒸水定容至100ml，滤纸过滤除去不溶物；堆积胶贮存液：Acrylamide30gN,N-methylene-bis-acrylamide 0.8g双蒸水定容至100ml，滤纸过滤除去不溶物；分离胶缓冲液：Tris base (3mol/L) 三羟甲基氨基甲烷36.342gSDS (0.3% ，十二烷基磺酸钠)0.3g用6mol/L HCl调整pH值为8.9，双蒸水定容至100ml；堆积胶缓冲液：Tris base (1mol/L)6.057g用6mol/L HCl调整pH值为6.8，双蒸水定容至50ml；阳极缓冲液：Tris base (0.2mol/L)24.228g6mol/LHCl调整pH值为8.9，双蒸水定容至1000ml；阴极缓冲液：Tricine (0.1mol/L)17.92gTris base (0.1mol/L)12.114gSDS (0.1%)1g自然pH值约为8.25，双蒸水定容至1000ml；过硫酸铵：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20贮存；TEMED：分装成每份1mL，4避光贮存染色液：冰醋酸Glacial acetic acid，20mL考马斯亮蓝Coomassie brilliant blue；0.05g加双蒸水搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；180mL样品缓冲液：10%SDS1mL甘油2.4mLTris-HCl(1mol/L，pH6.8)1mL巯基乙醇0.4mL溴酚蓝Bromomphenol blue0.002g加双蒸水搅拌溶解5mL其他器材：容量瓶(1L、100ml、10ml)、烧杯、离心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。凝胶配方：分离胶：(两块胶，20%T，3%C)双蒸水2.233ml分离胶缓冲液3.333ml分离胶贮存液4.522ml甘油1.067ml10% AP34mlTEMED4ml空间胶：(两块胶，16.5%T，3%C)双蒸水1.38ml分离胶缓冲液1ml分离胶贮存液0.6ml10% AP10 mlTEMED1 ml堆积胶：(两块胶，3.9%T，2.6%C)双蒸水2.94ml堆积胶缓冲液0.542ml堆积胶贮存液0.741ml10% AP43 mlTEMED3ml样品处理：在密封的螺盖微量离心管中，将超低分子量标准蛋白溶液按1:40的比例用1样品缓冲液稀释，65加热2分钟，每孔加10ml；在密封的螺盖微量离心管中，将样品溶液用1样品缓冲液等比例稀释，100加热5分钟，每孔加20ml；凝胶制备：将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上；按配方制备分离胶，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，留出足够的空间(堆积胶厚度约1cm；空间胶厚度约0.5cm)。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用；在室温条件下，凝胶应在60min左右聚合完成。倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水。按配方制备空间胶，加入TEMED前抽真空10min，加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入分离胶上方，厚度约0.5cm，在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇；在室温条件下，凝胶应在40min左右聚合完成。倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水。按配方制备堆积胶，加入TEMED前抽真空10min，加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入空间胶上方，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以免影响凝胶的聚合；在室温条件下，凝胶应在30min左右聚合完成。堆积胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。加样：将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入阴极缓冲液没过加样孔，并确保没有阴极缓冲液从电泳上槽漏出；电泳下槽内加入阳极缓冲液，倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡。按预定顺序加样，每孔加入20mL，在对照孔中加入分子质量标准品10mL，如有空置的加样孔，加入等体积的1加样缓冲液。电泳：将电泳装置与电源连接进行电泳，样品在堆积胶和空间胶阶段电压为70V，而在分离胶阶段电压调整为120V。直到溴酚蓝到达分离胶的底部后，关闭电源，这个过程大约需要3小时。固定：从电泳装置上卸下玻璃板，小心剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位；先将凝胶用双蒸水清洗5分钟，以降低背景色；将凝胶用新鲜配制的5%的戊二醛溶液固定1小时；将凝胶用双蒸水洗涤5分钟，重复3次。 染色：将凝胶浸泡在染色液中，置于摇床上染色4hr，染色液可回收重复利用。脱色：染色结束后，将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3次；用染色液染色1小时；用10%的冰醋酸溶液脱色过夜，其间更换3次脱色液。记录：将显示蛋白条带的凝胶用凝胶成像仪拍照，记录试验结果，并计算目标蛋白的分子量。Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1