伏伏曲培养微生物及理化指标的研究.doc

伏曲培养过程中微生物及理化指标的研究 王世宽，侯华，张强，沈才萍，李浩，冉然四川泸州地处潮湿的河谷地带，温度较高，湿度较大，有利于微生物的生长繁殖，为优质的泸州大曲提供了天然的生态环境。俗话说“水是酒的血，曲是酒的骨”，好水造美酒，好酒必有好曲。现在有的名酒厂家，无不重视制曲。学者们不断的研究制曲工艺，使制曲工艺逐渐走上规范化。在制曲的过程中，夏季曲培往往存在挂衣差、成曲皮张后、曲块死板、曲香味不明显、红心曲和黄心曲等一些不明因素，导致出酒率低和酒质差。所以，对夏季大曲制曲过程中微生物及理化指标消长的研究很有必要，以求明白其中的规律和机理，将其用于生产，改良酿酒工艺，降低消耗，将推动现在酒业的快速发展。1. 材料与方法1.1 样品与处理样品：中高温地区（地表曲），由泸州老窖生物工程有限责任公司提供。 采样标准：参照泸州大曲制曲标准选取优质大曲。样品处理：无菌条件下以几何中心进行4等分，随即挑选一份用灭菌榨汁机进行粉碎，再用灭菌研钵进行碾碎后充分混匀。1.2 培养基霉菌培养基，酵母培养基，细胞培养基，芽孢培养基，放线菌培养基，乳酸菌培养基。1.3计数操作1.3.1 菌总数计数将大曲在无菌条件下粉碎，取1克置于装有99毫升无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇动三角瓶使其混匀大曲粉，使其形成悬浊液不断摇动，30分钟后静置澄清。用无菌吸管吸取1毫升菌悬液与装有9毫升无菌水的试管中，进行系列稀释，取10的负3次方、负4次方、负5次方、和负6次方进行平板涂布。然后37倒置培养12天，进行总细菌计数。1.3.2 与以上操作方法相同，称取1克大曲粉装于有99毫升无菌水带有玻璃珠的三角瓶中，80水浴处理1015分钟，杀死非芽孢杆菌，然后进行稀释，取10的负3次方、负4次方、负5次方、和负6次方进行平板涂布，37倒置培养12天，计数即为芽孢菌数，并结合境检。1.3.3 乳酸菌计数取适当稀释度的样品菌悬液1毫升注入无菌平皿的中心，立即将融化后的乳酸菌培养基（5055）注入平皿，迅速摇动，使菌体在培养基中均匀分布，静置，冷凝；重复以上操作，再注入一层琼脂培养基。最终形成3层培养基组成的平板，以抑制霉菌和其他好氧微生物的生长。1.3.4 酵母菌、霉菌和防线菌的计数酵母菌和霉菌的计数同细菌的计数方法，取10的负3次方、负4次方、负5次方、和负6次方进行平板涂布，28倒置培养37天，进行计数。1.4 理化指标测定方法烘干法测定水分；中和法测定酸度；廉爱农法测定淀粉；斐林氏法测定糖化力；碘反应退色法测定液化力。1.5 相关性处理软件SPPS，相关性分析是通过样本数据，研究两变量间线性相关程度地强弱，它反映的是控制其中一个变量的取值后，另一个变量还有多大的变异程度。1.6 回归方程分析软件回归方程分析采用Minitab15软件。2 结果与分析 表1 曲药发酵过程中维生物测定结果对数转换值时间温度（）湿度（%）乳酸菌放线菌酵母菌细菌霉菌第1天28455.5294294.456674.9126555.0238810.875469第3天43805.8998972.803367.0900776.2146085.038899第5天48965.8464392.5952557.0030656.3279376.336826第7天52815.2538291.6677076.551086.7684936.866933第9天35605.5012581.6094385.5214617.0210847.44132第20天32565.298312.760014.7874928.3064726.932448第40天30504.4067193.0349535.8579338.2160886.813994表2 曲药发酵过程理化指标的测定时间水分（%）酸度（度/10克）糖化力(Mg/gh)液化力（g/gh）淀粉含量发酵力第1天30.271.03690.2572.183.43第3天28.672.16670.4771.874.86第5天27.841.657750.6070.280第7天262.37850.6267.3858.86第9天211.237190.566.8961.86第20天13.50.953290.3866.3273.33第40天12.81.16470.5666.5765.71表3 温度、湿度与微生物菌落数的相关性项目细菌酵母菌放线菌乳酸菌霉菌温度0.957*0.785*-0.560.891*-0.007Sig.(2-tailed)0.0430.0360.1910.070.998N47777湿度-0.4490.890*-0.3220.698-0.449Sig.(2-tailed)0.3120.0070.4810.0810.312N77777注：*correlation signifidant at the 0.01 lvel,*correlation significant at the 0.05 level (2-tailed)。表4 水分含量与微生物消长的相关性项目乳酸菌放线菌细菌酵母菌霉菌水分含量X0.762*0.191-0.494*0.453-0.591Sig.(2-tailed)0.046*0.6810.0010.3080.612N77777表5 酸度与乳酸菌落数相关性项目菌落数X酸度值菌落数10.941*Sig.(2-tailed)00.02N77酸度值Y0.941*1Sig.(2-tailed)0.020N77表6 芽孢杆菌、霉菌与淀粉的相关性项目芽孢杆菌X1霉菌X2淀粉Y-0.765*-0.872*Sig.(2-tailed)0.0450.011N77表7 细菌、酵母菌和霉菌与糖化力的相关分析表项目细菌酵母菌X1霉菌X2糖化力0.2720.774*0.755*Sig.(2-tailed)0.5550.0410.50N7772.1 大曲微生物的计数及消长规律从表1和表2结果分析可知，培养期：培养前期温度和湿度都很接近于环境，当原料加水发酵时，细菌、酵母菌和霉菌均呈现一定程度地增长，同时随着湿度增加，霉菌的孢子也正在准备萌芽。培曲中期温度和湿度变化程度较大，其中细菌、酵母菌和霉菌生长繁殖开始活跃起来，增长幅度很大，其代谢机能非常的活跃，酶的活性增强，糖化力和发酵力呈现增强的趋势，淀粉物质和一些微量物质逐渐被消耗，释放大量的热，使曲块和曲房的温度和湿度迅速上升，为霉菌孢子萌芽提供了条件。随着温度的升高，大曲里面的水分迅速蒸发，也使曲房的湿度迅速增加，在培曲的后期，高温环境使得微生物的生长受到了抑制，部分好氧菌的数量很少，而芽孢杆菌所具有的耐热性使其在该环境下数量增加，酵母菌和霉菌其繁殖方式与细菌不同，繁殖的速度不如细菌，增加的数目也没有细菌多，此过程微生物繁殖代谢仍十分旺盛，此时曲块中的酸度达到了最高（2.3度/10克）；淀粉含量消耗最大，达到了2.83%；糖化力和液化力均达到了整个发酵过程中的最高，而发酵力略有所减少。因此，适当控制高温期的发酵时间，可以大量堆积更多的发酵产物。堆积转化期：当大曲温度培养温度降到35，此时的微生物总数有所下降，所需的营养物质逐渐耗尽，特别是大曲中微量元素的殆尽。培曲期微生物代谢的有机酸等物质（酸度增加）及品温的升高抑制了微生物的生长，总体上微生物的繁殖速率迅速下降，此时，微生物细胞的原生质开始积累储藏大量的物质，发酵力略有回升。此阶段大多数的芽孢细菌在此时形成了芽孢，乳酸菌数量下降，可能霉菌在代谢过程中产生的抗生素抑制了生酸菌的繁殖，这有待进一步验证。储存期：大曲曲块的品温开始逐渐接近夏季环境温度，微生物的死亡率逐渐高于繁殖率，死亡的细胞逐渐多于新生细胞，或细胞逐渐减少，新陈代谢的猪肚逐渐减弱，释放的热量逐渐放缓，促使培曲的温度逐渐减小，部分菌体在自身的酶和新陈代谢产物的作用下而自溶死亡。经过20天的后熟，曲块水分下降，酸度值、液化力和糖化力均有较大的回升。2.2 培养条件对微生物影响分析2.2.1 温度、湿度与微生物菌落消长关系的分析（表3）从表3可以看出，温度和细菌、酵母菌和乳酸菌菌落数呈现强或较强的相关性，而湿度只是和酵母菌有很强的相关性,而和其他几种没有很好的相关性，说明在整个大曲发酵的过程中，温度对微生物的生长变化有较大的影响，湿度对酵母菌的影响很大。在大曲发酵的过程中，各种微生物的生长情况不一样，导致在不同阶段为大曲积累了大量的代谢产物，有好的代谢产物或者有害的代谢产物，因此可以通过温度较好的控制大曲微生物的生长情况，使代谢产物朝着有利于的生产的优质大曲方向积累，使大曲的质量更上一个台阶。下面对酵母菌和温度、湿度的方程拟合以及乳酸菌和温度的方程拟合，以供参考。酵母菌和温度的拟合方程： Y=44.213.34X+0.9198X0.000802X酵母菌和湿度的拟合方程： Y=3.682+0.04873X乳酸菌和温度的拟合方程： Y=3.037+0.0437X2.2.2 水分含量对微生物消长的影响（表4）从表4可知，大曲水分含量与乳酸菌的消长变化呈 正相关性，和细菌呈现负相关性，且显著性很强。水是生命活动的重要成分，对微生物的生长离不开水分，在制曲的不同阶段，对水分的要求亦不相同，制曲用水的一个重要性就是调节品温。霉菌所需水分不多，随着水分的下降霉菌的数量呈上升的趋势。酵母菌生活环境需要较潮湿和低温，但是夏季潮湿的环境为酵母的生长提供了有利的条件，仍然是酵母的消长大致呈现上升的趋势。通过Minitab15对水分回归拟合得到拟合方程。乳酸菌与水分含量的拟合方程： Y=0.7670.417X0.008412X放线菌与水分的拟合方程： Y=14.471.284X0.03097X细菌与水分含量的拟合方程： Y=62.118.899X0.4379X0.006808X酵母菌与水分含量的拟合方程： Y=31.053.451X0.1649X0.002615X霉菌与水分含量的拟合方程： Y=70.2710.41X0.5451X0.00913X2.3 微生物菌落数与理化指标的关系分析2.3.1 酸度与乳酸菌消长变化关系的分析（图1，表5）从图1中可以看出，发酵期间的酸度值和乳酸菌菌落的走势基本一致，而微生物新陈代谢产生的有机酸被消耗或转化成了别的物质，参与其他化学反应，故而开始走势偏低，到6天后的乳酸菌的数量下降很快，酸度下降也很快，到成熟期乳酸菌和酸度比较平稳。从表5的相关性分析看，相关系数是0.941，p是0.02，故菌落数和酸值呈较好的正相关关系。同时还有短杆菌、链球菌和地霉等具有一定的产酸能力，还需要进一步研究其数量变化是否对产酸、产酸物质的影响，并对各种脂类的形成的研究提供科学的依据和来源。通过Minitab15 对乳酸菌回归拟合得到拟合方程如下： Y=21.108.276X+0.8466X2.3.2 淀粉量与芽孢杆菌、霉菌消长的变化关系（表6）芽孢杆菌在发酵过程中的作用及产物主要是产生-淀粉酶、蛋白质和己酸已酯，期间-淀粉酶会对小麦的淀粉充分分解，同时米曲霉、黄曲霉和霉菌均对淀粉呈现较强的负相关性，其数量变化对淀粉的消耗形成了显著地影响，从整个淀粉的变化看，变化的趋势不大最高值是7.21%，最低值是66.32%，R为5.78%，但是对整个发酵有很大的影响，为微生物的生长代谢提供了营养物质，为大曲有益代谢产物积累奠定了基础。通过Minitab15对芽孢杆菌和霉菌回归拟合得到拟合方程。淀粉含量和芽孢杆菌的拟合方程： Y=70.63+2.032X0.3608X淀粉含量和霉菌的拟合方程： Y=33.4083.53X20.85X+1.618X2.3.3 糖化力与细菌、酵母菌、霉菌消长关系（表7）从表7可以看出，大曲中主要有3类微生物，霉菌、酵母菌、与糖化力构成正相关性，相关性显著。对糖化力影响较大的霉菌同时也为酵母提供了发酵的底物和繁殖营养，酵母的数量和霉菌种类变化是息息相关的。通过Minitab15对酵母菌和霉菌回归拟合得到拟合方程。糖化力和酵母菌的拟合方程： Y=8263+2803X216.9X糖化力和霉菌的拟合方程： Y=167.3+293.9X25.38X3 结论3.1 从整个大曲发酵的3个阶段来看，随着温度和湿度的变化，曲药各种微生物还和理化指标的变化呈现出一定的规律，微生物的消长将导致理化指标的变化，发较过程中温度对乳酸菌、酵母菌和细菌的生长都构成显著影响，呈现较好的正相关性，而湿度只是对酵母菌的影响较为显著，呈较好的相关性，所以期间对温度和湿度的控制管理很重要，使微生物充分生长，大量形成酶系和积