氨基酸检测方法ppt课件.ppt

氨基酸分析 1958Spackman SteinandMoore第一次实现氨基酸自动分离和定量 NH2RCCOOHH UV 210nm 1 氨基酸衍生化方法 柱后衍生柱前衍生 氨基酸 衍生化后的氨基酸 试剂 色谱柱 检测器 色谱柱 检测器 2 氨基酸 试剂 色谱柱 检测器 柱后衍生 色谱柱 阳离子交换柱试剂 茚三酮方法 UV VIS检测器OPA方法 荧光检测器 3 柱后衍生化分离柱 阳离子交换柱使用阳离子交换柱 峰分离度较差 分析所有的氨基酸所需时间较长 蛋白质水解氨基酸 45min 生物体氨基酸 120min 4 茚三酮方法 伯氨基酸和仲氨基酸 亚氨基酸 检测 440nm 脯氨酸 or570nm primary 反应温度 130 反应速度 快速试剂稳定性 不稳定 必须冷藏 衍生化产物稳定性 稳定 5 茚三酮方法 阳离子交换柱 UV VIS检测器 茚三酮试剂 130 氨基酸 柱温箱 反应器加热器 6 OPA方法 邻苯二甲醛 伯氨基酸检测 荧光检测器 Ex 350nm Em 460nm 反应温度 室温反应速度 快速试剂稳定性 较差衍生化产物稳定性 较差 7 脯氨酸和羟基脯氨酸分析 脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂发生反应在与OPA反应前两种氨基酸应先使用下列试剂进行氧化次氯酸盐氯胺 T 8 OPA衍生反应辅助试剂 有硫醇存在时 OPA才会与伯氨基酸发生反应 乙硫醇2 硫基乙醇3 硫基丙酸 非挥发性 9 OPA方法 阳离子交换柱 荧光检测器 氨基酸 柱温箱 OPA试剂 次氯酸盐 10 茚三酮方法和OPA方法比较 11 衍生化后的氨基酸 色谱柱 检测器 柱前衍生 色谱柱 反相柱 ODS 试剂 OPA 荧光检测 FMOC 荧光检测 荧光胺 荧光检测 DANS Cl 荧光检测 PITC UV 12 柱前衍生分离柱 反相色谱柱 ODS 使用反相柱 色谱峰分离良好 分析某些类型的氨基酸所需时间很短蛋白质水解氨基酸 20min 生物体氨基酸 60min 13 OPAMethod o phthaldialdehyde 伯氨基酸检测 荧光检测器 Ex 380nm Em 420nm 反应温度 室温反应速度 快速 14 OPA柱前衍生化色谱图 生物体氨基酸标准品 Shim packCLC ODS 15 FMCO方法 9 fluorenylmethyoxycarbonylchloride 通用试剂 用于缩氨酸N端保护 16 荧光胺方法 pH 7时与伯氨基酸快速反应易于水解 17 DANS Cl方法 1 dimethylaminonaphthalene 5 sufonylchloride 与伯氨基酸和仲氨基酸反应效率低 18 PITC方法 phenylisothiocyanate ForpeptideandproteinsequencingasEdman抯reagent伯氨基酸和仲氨基酸 碱性条件 反应时间长使用UV检测器 灵敏度低 PITC PTC 19 PTC 氨基酸色谱图 STRODS II 氨基酸标准品 20 自动氨基酸分析仪 对于 柱前 和 柱后 自动氨基酸分析仪来说 采用何种方法更好 要控制反应时间 采用柱后衍生方法更方便 这就是为什么采用柱后衍生法所得结果之重复性更好的原因 柱后衍生重复性 RSD约为1 柱前衍生重复性 RSD 2 21 Shimadzu氨基酸分析系统 22 氨基酸分析流程图 23 分离柱 强酸性阳离子交换树脂 带有磺化基团的苯乙烯 二乙烯基苯共聚物 Na型andLi型Shim packAMINO Na 用于水解氨基酸分析Shim packAMINO Li 用于生物体氨基酸分析 24 水解氨基酸色谱图 25 生物体氨基酸色谱图 26 流动相 Na型 A溶液 0 2N柠檬酸钠 用高氯酸调pH至3 2 B溶液 0 6N柠檬酸钠 0 2M硼酸 用4MNaOH调pH至10 0 C溶液 0 2NNaOH 用于清洗色谱柱 Li型 A溶液 0 15N柠檬酸锂 7 甲氧基乙醇 用硼酸调pH至2 6 B溶液 0 3N柠檬酸锂 0 2M硼酸用4MLiOH调pH至10 0 C溶液 0 2NLiOH 用于清洗色谱柱 27 PH梯度 HHHR C COOHR C COOHR C COO NH3 NH2NH2 分离是通过离子力进行的 28 N acetylcystine作为辅助试剂 29 什么是氨捕集柱 流动相中的氨 无捕集柱 有捕集柱 30 重复性 各250pmol n 10 31 线性 32 高灵敏度分离色谱图 25pmol氨基酸标准品 33 样品预处理 脱脂去蛋白蛋白质水解样品稀释过滤 34 脱脂 脂类组分会影响分析柱使用弱极性溶剂乙酸乙酯氯仿正己烷等两相分离后 水相必须使用0 45um滤膜过滤 35 除蛋白 蛋白组分会干扰氨基酸的分离除蛋白试剂酸性溶剂方法有机溶剂方法超滤方法蛋白沉淀物必须采用离心 3000rpm 5min 或过滤方法除去 36 酸性溶剂方法 三氯乙酸 5 10 水溶液 高氯酸 0 1 1 水溶液 除去蛋白后 通过加NaOHorLiOH以中和溶液 溶液呈酸性时会影响色谱保留时间 37 有机溶剂方法 乙腈乙醇聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂 如果采用有机溶剂方法 进样量应尽可能小 38 超滤方法 效率高成本低 39 老鼠血清中游离氨基酸分析 40 牛尿中游离氨基酸分析 41 猪血粉中游离氨基酸分析 42 茶叶中游离氨基酸分析 43 蛋白质水解 1 高氯酸水解方法6N HCl110C N2氛围 22 72hours色氨酸 半胱氨酸 蛋氨酸分析不能用此水解方法 可用其它方法 天冬酰胺酸和谷氨酸转换成酸的形式 44 蛋白质水解 2 碱水解方法4NNaOH110C N2氛围 16 24hours这一方法用于色氨酸 45 蛋白质水解 3 过甲酸氧化方法A B 5 95110C N2氛围 A 30 过氧化氢B 90 甲酸22 72h这一方法用于半胱氨酸 胱氨酸和蛋氨酸分析 46 盐酸水解方法实例 从胰腺得到的胰岛素中的水解氨基酸分析 47 氨基酸残留基团测定值和理论值比较 48 碱水解方法实例 意大利草中水解氨基酸分析 49 过甲酸氧化方法实例 人发中水解氨基酸分析 50 样品稀释 0