小鼠不同发育阶段肾小体细胞增殖的实验研究.doc

小鼠不同发育阶段肾小体细胞增殖的实验研究【摘要】目的 研究小鼠不同发育阶段肾小体细胞增殖的规律并探讨其作用。方法 选择不同胚龄和生后日龄小鼠肾脏做常规光、电镜标本，并采用免疫组织化学方法测定不同发育阶段肾小体内PCNA阳性细胞表达率。结果 PCNA免疫组织化学染色显示在和期肾小体内几乎所有细胞呈PCNA强阳性反应，、期肾小体内PCNA阳性细胞数逐渐减少，在期肾小体内PCNA阳性细胞少见。电镜观察所见：早期肾小体（、）所有细胞核分裂相机率均高，期肾小体中的内皮细胞、足细胞核分裂相机率高，期肾小体中只见到内皮细胞核分裂相。结论 研究结果说明细胞增殖在小鼠肾小体发育、形成中有着重要的作用。 【关键词】 肾小体 发育 细胞增殖Study on Proliferation in Developing Renal Glomeruli in MiceWANG Xu，GUO Min（Department of Histology and Embryology， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 111001 China;Department of Histology and Embryology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001 China）【Abstract】 Objective To study the rules of cell proliferation in mouse glomeruli at different stages of development. Methods The embryonic and postnatal mouse kidneys were choosed for study by light and electron microscopy,and PCNA immunohistochemistry method were used to observe proliferation within corpuscle at different stages of development. Results Nearly all cells in and stages had nuclear PCNA immunolabeling.The number of PCNA immunolabeling cells during and stages was gradually decreased,and to less in stage.Electron microscopy revealed that the mitotic activity was observed in all cells of and stages renal corpuscles.The mitotic phases of endothelial cells and podocytes could be seen in stage,but only endothelial mitotic activities in IV stage of renal corpuscle.Apoptotic activities of endothelial cell and Bowmans parietal cell were noted. ConclusionsThe results suggest that proliferation play an important role in the formation of glomeruli. 【Key words】 renal corpuscle；development；celluar proliferation肾脏发育的基础是细胞的增殖与分化，它存在于肾脏发生发育的全过程。但在肾脏发育的不同阶段细胞的增殖分裂状况有着不同的变化，其增殖状况的变化与肾脏的结构和功能有着密切的关系。PCNA作为一种核内蛋白，它的合成和表达与细胞增殖状态密切相关，故近年来学者们把它作为衡量胚胎发育中组织内细胞增殖水平的一个客观指标。因此它表达的多少、时间和部位可直接反映肾脏发育中的增殖规律。目前关于不同阶段小鼠肾小体中的细胞增殖的定量研究较少，因此本文通过PCNA染色方法及电镜技术对小鼠发育不同阶段肾小体细胞增殖进行了系统观察，现报告如下。1 材料和方法1.1 动物选择和胚（日）龄计算 选用成年健康昆明小白鼠，雌、雄同窝饲养，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄（embryonic days，E）0天。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养。饲养2周后，每日早8时、晚5时观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后（neonatal days，N）0天。记录出生日期，与母鼠同窝饲养。选取E14，E16，E18天胎鼠，生后1，3，7天仔鼠处死。取出左右肾脏进行观察。每组取4只鼠，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。1.2 光、电镜标本的制作 将孕鼠用乙醚麻醉后剖腹取出胎鼠，胚龄14、16、18天的胎鼠剖腹取出左右肾脏。生后1，3，7天仔鼠行断头法处死后取出左右肾脏。左肾入10%甲醛固定，常规光镜标本制作，定向石蜡包埋切片，厚5.0μm，免疫组织化学染色，光镜下观察。右肾入2.5%戊二醛浸润固定，树脂定向包埋，LKB-V型超薄切片机半薄切片，厚度1.0μm，甲苯胺兰染色，光镜观察。并在各个阶段肾小体定位后行超薄切片，厚度5070nm，醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，1200EX（JEOL）透射电镜观察。1.3 免疫组织化学法检测PCNA1.3.1 染色步骤 将石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育，以消除内源性过氧化物酶活性。经pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中行抗原热修复，5%正常山羊血清封闭后加入PCNA（1：100），4过夜。滴加生物素标记的二抗37孵育30min，滴加SABC试剂37孵育30min DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明，封片，光镜下观察。以上各步骤均用PBS冲洗，同时另用PBS代替一抗作为阴性对照。1.3.2 结果判定 PCNA阳性表达定位于肾小体细胞核内，呈不同程度棕黄色，而PCNA阴性细胞的细胞核完全被苏木素染成紫蓝色。1.3.3 细胞增殖指数（Proliferation Index，PI）测定 增殖指数是以一个肾小体内明显的增殖阳性染色细胞占整个肾小体细胞总数的百分比表示。在肾小体发育完全之前，在同一胚日龄肾脏内可观察到不同发育阶段（期）的肾小体。每一胚日龄肾脏标本取4张PCNA阳性切片，每张切片分别系统随机选取5个同期的肾小体，在CIAS-1000 细胞图像分析仪上进行细胞记数。计算出肾小体的总细胞数和PCNA阳性细胞数，即PI(Proliferation Index)=PCNA阳性细胞数细胞总数1。1.4 统计分析 实验结果以均数标准差（xs）表示。采用单因素方差分析F检验及两两比较q检验。数据处理均应用SPSS统计分析软件。 2 结果2.1 PCNA染色结果 在生肾区内的逗号小体和S小体出现时，PCNA阳性细胞率很高（图2，图3），PCNA阳性细胞百分数（%，xs）分别为（87.127.19）和（78.866.40）。进入期肾小体时，PCNA的表达有所减少（44.298.20）。在期肾小体内PCNA阳性率继续减少（22.515.09）。在成熟的肾小体（期）内仅有小部分细胞核呈PCNA阳性反应(9.312.08)，其变化趋势见图1。2.2 电镜结果 电镜下细胞增殖最明显的表现是细胞核分裂相。细胞核分裂相出现机率最高的是逗号小体和S小体(图4)。特别是毛细血管侵入两种小体进入到裂隙后，原始的足细胞、内皮细胞以及肾小囊壁层细胞均可见细胞核分裂相。当肾小体进入期时，细胞核分裂相机率虽不如逗号小体和S小体，但内皮细胞核分裂相（图5）、足细胞核分裂相还是经常能遇到。处于期的肾小体核分裂相多发生在内皮细胞，足细胞核分裂相少见。成熟肾小体分裂相少见。3 讨论 肾小体的发育过程大致可分为三个阶段，即早期肾小体（期，期）、中期肾小体（期，期）和晚期肾小体（期）2。小鼠肾小体是在E14天开始出现的，在输尿管芽分支周围出现、和期肾小体（生肾区）。E1618天 后肾中期和期肾小体出现。生后13天皮质内各发育阶段肾小体增多，生肾区依然可见。肾小体的发生一直到N7天停止，肾被膜下生肾区消失。这一点与人的肾脏发育是不同的3,4。 PCNA是存在细胞核内的一种酸性蛋白质，它和复制因子C（RFC）一起识别引物-模板复合物，以帮助聚合酶δ的定位，从而促进DNA的复制5。PCNA是一种只出现在处于细胞增殖状态的细胞中，在细胞增殖分裂的S期达到高峰，因此PCNA阳性细胞着色多少可反应出细胞增殖的状态。 通过实验发现期和期肾小体中PCNA阳性表达率最高，其原因是逗号小体和S小体实际上是肾单位的原基，在研究肾小体发生和发育生物学中它们被认定为期和期肾小体6，其中所有的细胞都属于干细胞，其细胞具有高分化潜能和增殖能力，因此PCNA阳性率很高是可以理解的，它们多位于皮质表面生肾区内。而期和期肾小体是发育中的生长阶段，主要为毛细血管袢的增多和增长，同时毛细血管质量也在改善，如由连续内皮逐渐改建为有孔的内皮，滤过屏障逐渐形成，这些改变不是完全由细胞增殖所能实现的，同时也需要通过细胞调亡来从细胞的数量和质量上把那些过多的增殖细胞处理掉，及时消除异常、衰老的细胞及暂时性结构7。因此PCNA细胞阳性率下降。期肾小体已近成熟，发育基本停止，细胞增殖处于最低状态。随着肾小体的逐渐发育成熟，细胞增殖能力减弱，在肾小体形态形成过程中共同发挥着重要的塑形作用，从而保证肾小体的正常发育成熟。 我们在电子显微镜下观察细胞增殖的结果说明：早期肾小体的各种细胞均出现高机率的细胞核分裂相，此时细胞处于高度增殖状态。在、期肾小体内毛细血管内皮细胞分裂相可见的机率仍然较高,说明在肾小体发育过程中毛细血管袢的增多、增长，需要内皮细胞增殖来完成，而且是肾小体发育的主要内容。伴随内皮细胞的增生，早期(、期)足细胞的增殖是可以理解的。但进入晚期阶段（、期）足细胞分裂相少见的原因可能是此时足细胞数量已够，只需要伸出足突来包裹毛细血管形成滤过屏障的原因。Nagata等认为当毛细血管袢发育近成熟时足细胞便失去了增生分裂的能力8,我们的观察证明了这一点。【参考文献】 1Ogata K,Ogata Y,Nakamura RM,et al.Purification and N-terminal amino acid sequence of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)/cyclin and development of ELISA for anti-PCNA antibodiesJ. 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