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喹诺酮类药物残留检测方法 深圳出入境检验检疫局岳振峰yuezhenfeng 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 2 主要内容 1概述2常见检测方法3高效液相色谱法 HPLC 4液相色谱串联质谱法 LC MS MS 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 3 1概述1 1喹诺酮类药物的分类 喹诺酮类 quinolones QNs 抗菌药是指人工合成的含有吡酮酸 1 4 二氢 4 氧吡啶 3 羧酸 基本结构的一类抗菌药物 按母环的差异可分为喹啉类 萘啶类 吡啶并嘧啶类和噌啉类 按其发展历史 目前可分为三代药物 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 4 第一代 萘啶酸 恶喹酸和吡咯酸 由于抗菌谱窄 半衰期短 毒副作用强和细菌耐药性等原因 现已很少应用 第二代 吡哌酸和氟甲喹 第三代 沙拉沙星 单诺沙星 恩诺沙星 环丙沙星 诺氟沙星 氧氟沙星 二氟沙星 麻保沙星等氟喹诺酮类 fluoroquinolones FQs 由于抗菌谱广 抗菌作用强 已逐渐成为该类药物的主流 1概述1 1喹诺酮类药物的分类 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 5 1概述1 2氟喹诺酮类药物的结构 氟喹诺酮类药物的共同特点是喹啉环 个别为萘啶环 的C 6位上有氟原子 C 7位上连接哌嗪基或吡咯基 又称为6 氟喹诺酮类 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 6 1概述1 3喹诺酮类药物的性质 QNs均为白色或淡黄色晶型粉末 游离酸形式一般易溶于稀碱 稀酸溶液和冰醋酸 在pH6 8的水中溶解度最小 在多数有机溶剂中难溶或不溶 QNs在C 3位含有羧基 在C 7位连接哌嗪等含氮碱性基团 因此属酸碱两性化合物 这也是设计提取 净化和分离方法的主要依据 QNs结构中含有苯并杂环或并杂环骨架和羰基 羧基 杂原子等组成的共轭系统 在紫外区具有特征性和强的吸收 在酸性介质中具有较强的稳定荧光性质 对光照 温度和酸 碱具有较好的稳定性 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 7 1概述1 3喹诺酮类药物的药理学与毒理学 QNs对革兰氏阴性菌 支原体和一些革兰氏阳性菌具有强大的杀灭作用 组织渗透能力强 毒副作用低 可用于呼吸道 肠道 泌尿 皮肤和深部组织感染或败血症的治疗 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 8 1概述1 3喹诺酮类药物的药理学与毒理学 但QNs同时也是人类最有效的抗菌药之一 由于细菌对喹诺酮类药物耐药性的产生和某些喹诺酮类药物的潜在致癌性质 其残留问题已引起广泛关注 2003年我国的鳗鱼产品就曾因氟喹诺酮类药物残留问题出口日本受阻 包括我国在内的许多国家和地区都对喹诺酮类药物的使用范围和最大残留限量做出规定 根据不同动物品种和药物种类 MRL在30 1900 g kg之间 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 9 1概述1 4喹诺酮类药物的代谢与残留 QNs在动物体内分布很广 一般肝 肾组织中浓度最高 肌肉 血浆中浓度最低 QNs主要经肾和胆管排泄 故尿液或胆汁中药物浓度较高 另外QNs可以代谢进入毛发而长期存在 氟甲喹和恶喹酸可进入骨骼组织而蓄积 组织中QNs残留物主要是原形药物 一般选择原形药物作为残留标示物 但恩诺沙星的残留标示物为恩诺沙星及其主要代谢产物环丙沙星 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 10 2常见测定方法 微生物抑制法酶联免疫法放射免疫法HPLC法LC MS MS法 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 11 3高效液相色谱法 HPLC 3 1原理及适用范围 将均质样品以1 醋酸 乙腈溶液提取喹诺酮类药物残留 提取液用正已烷净化 用配有荧光检测器的高效液相色谱仪测定 适用于畜 禽 水产品组织中氧氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星 丹诺沙星 沙拉沙星 氟甲喹的同时检测 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 12 3高效液相色谱法 HPLC 3 2检测流程 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 13 加入15mL1 醋酸 乙腈溶液 均质1min后放入超声波池中超声5min 3500r min 离心5min 合并上清液 残渣 上清液 重复提取1次 上清液 3高效液相色谱法 HPLC 3 2检测流程 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 14 15mL乙腈饱和正己烷脱脂净化 乙腈层 弃去正己烷层 3高效液相色谱法 HPLC 3 2检测流程 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 15 于45 水浴中旋转蒸发近干 用氮气吹干 3高效液相色谱法 HPLC 3 2检测流程 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 16 在残渣中加入2mLHPLC流动相2 快速混匀和超声3min溶解残渣 2mL正己烷脱脂 弃去正己烷层 注射器滤膜 0 45 m 过滤 3高效液相色谱法 HPLC 3 2检测流程 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 17 HPLC FLD 3高效液相色谱法 HPLC 3 2检测流程 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 18 色谱柱 4 0mm 250mm 5 m HyprsilODS柱温 30 进样量 20 LA 0 01mol L磷酸盐 三乙胺缓冲液 80 20 pH3 0 B 乙腈 流速 0 8ml min 3高效液相色谱法 HPLC 3 3色谱条件 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 19 检测波长 3高效液相色谱法 HPLC 3 3色谱条件 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 20 3高效液相色谱法 HPLC 3 4色谱图 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 21 种喹诺酮类药物的测定低限 LOQ 均为15 g kg 种喹诺酮类药物的线性范围均为 10 50 g kg 种喹诺酮类药物的回收率为64 106 3 相对标准偏差为1 3 9 5 3高效液相色谱法 HPLC 3 5方法的性能指标 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 22 试样中的喹诺酮类药物残留用酸性乙腈溶液提取 经正己烷脱脂净化 浓缩 定容后 用液质联用仪测定 子离子丰度比定性 外标峰面积法定量 适用于肌肉 肝脏 水产品 奶等动物源性食品中萘啶酸 恶喹酸 氟甲喹 诺氟沙星 依诺沙星 环丙沙星 洛美沙星 丹诺沙星 恩诺沙星 氧氟沙星 沙拉沙星 二氟沙星 麻保沙星 培氟沙星 司帕沙星 奥比沙星等16种喹诺酮类兽药残留的定性确证和定量测定 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 1原理及适用范围 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 23 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 2检测流程 LC MS MS分析 溶解 脱脂 过滤 旋蒸至近干 氮气吹干 2 15mL1 醋酸 乙腈溶液提取 5g样品 正己烷净化 在残渣中加入5mL流动相 快速混匀和超声3min溶解残渣 5mL正己烷脱脂 弃去正己烷层 注射器滤膜 0 45 m 过滤 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 24 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 2检测流程 LC MS MS分析 溶解 脱脂 过滤 旋蒸至近干 氮气吹干 2 15mL1 醋酸 乙腈溶液提取 5g样品 正己烷净化 LC MS MS ESI MRM模式检测 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 25 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 3仪器条件 液相色谱条件色谱柱 InertsilC8 3 5 m 150mm 2 1mmi d 或相当者 流动相 0 1 甲酸的乙腈溶液 0 1 甲酸的水溶液 梯度洗脱 梯度时间表见表1 流速 300 L min 柱温 30 进样量 30 L 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 26 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 3仪器条件 液相色谱条件 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 27 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 3仪器条件 质谱条件离子化模式 ESI 质谱扫描方式 MRM 分辨率 单位分辨率 雾化气 NEB 6 00L min 气帘气 CUR 12 00L min 喷雾电压 IS 5000V 去溶剂温度 TEM 500 去溶剂气流7 00L min 碰撞气 CAD 6 00mL min 氮气 其它质谱参数见表2 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 28 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 3仪器条件 质谱条件 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 29 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 4重构离子色谱图 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 30 液相色谱串联质谱法 LC MS MS 3 4重构离子色谱图 2020 1 7 岳振峰 SZCIQyuezhenfeng 3