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体外诊断试剂分析性能评估 线性范围 WYS EP6 A EvaluationoftheLinearityofQuantitativeMeasurementProcedures AStatisticalApproach ApprovedGuideline 22 本指南的目的旨在提供一种定量测量程序线性评价的统计学方法 确定一种方法的非线性浓度范围 及在每个浓度水平上非线性的程度 23 体外诊断试剂产品性能评估过程 01 02 03 04 05 06 07 01 02 03 04 05 06 07 确定线性范围 数据修正 基本原则 样本要求 数据收集 数据检查 数据分析 24 1 实验操作人员应熟悉方法原理与操作 能对样本进行正确处理 确保仪器工作状态正常 采用适当的校准品对仪器进行校准 2 仪器的各项性能指标 如精密度 合格 不存在明显的携带污染等 3 应使用同批号试剂及校准品 线性范围评估的基本原则 25 确定样本类型 为避免基质效应对结果的影响 进行线性评价时所选用的样本应与临床实验样本相似 但不可采用含有对测定方法具有明确干扰作用的样本 如溶血 脂血 黄疸或含有某些特定药物的样本 理想样本为分析物浓度接近预期测定上限的病人混合血清 可用其他病人样本将其稀释为预定浓度 EP6 A中建议应尽可能按以下顺序进行样本种类的选择 病人混合血清 用适当稀释液稀释的病人血清 添加分析物的病人样本 用处理过的低浓度物质或处理过的血清物质稀释的病人血清 商业质控品 校准品 线性物质 使用生理盐水稀释的样本 稀释不足或过度稀释的商业质控品 水溶液 其他溶剂的溶液 实验样本的基本要求和制备方法 26 建立线性范围 建议9至11个浓度 每个浓度下重复2至4次 验证内部方法或修正方法 建议7至9个点 每个浓度重复2至3次 验证线性范围在实验室有效 建议5至7个浓度 每个浓度重复2次 注意 当建立方法的线性范围时 应有20 到30 的样本的浓度范围超出预期的测量范围 但在可接受的线性响应范围内 样本数量的要求 27 不同浓度水平样本制备表 28 实验过程 所有样本应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定 最好在一天之内完成 29 数据分析方法 确定自己所要求的测量误差 偏倚 随机误差 不精密度 非特异性 干扰 的大小 初步数据检查 检查数据是否有极端明显的差异 或错误 无 有 目视每组数据点内有无离群点 无 有 一个 一个以上 如果需要 将每一组的检测数据按检测时间次序排列 检查是否有漂移或趋势性变化 观察每个浓度水平的响应值之间的差异 目视检查XY散点图对于后续的线性评估是非常重要的 它可以很容易的发现非线性 或测量范围是否太窄或太宽 也可以为后续的统计分析选择更合适的统计分析方法 设定偏差标准 30 确定线性范围 多项式线性评价 对实验数据进行一次 二次 三次多项式回归分析 具体的评价方法包括两部分 第一部分 检验非线性多项式是否较线性多项式与数据更为相符 第二部分 当非线性多项式拟合数据点比线性好时 判断最适非线性模型与线性拟合之间的差值是否小于预先设定的该方法的允许偏差 31 样品重复检测的随机误差评估 R 为重复测定的次数 j 1 2 3 R L 样本数ri 样本i处的平均值 L 样本数ri 样本i处的平均值 32 多项式回归方程 一次多项式模型中的b0和b1两个系数不用分析二次多项式模型中 b2为非线性系数 三次多项式模型中 b2和b3为非线性系数 计算每个非线性系数斜率的标准误SEi 可由回归程序算出 然后进行t检验 判断非线性系数是否有统计学意义 即与0之间有无差异 评价线性时至少要求五个不同浓度水平样本 每个水平重复测定两次 33 非线性系数b2 b3的t检验 t bi SEi 自由度计算公式 df L R Rdf L 不同浓度样本数 R 重复检测次数 Rdf 回归自由度例 三次多项式回归时 L 5 R 2 Rdf 4 df 5 2 4 6 查t值表 附录B 双侧 0 05 如非线性系数b2 b3与0比较 经t检验 p 0 05 存在线性关系 不精密度满足条件时 则分析完成 如二次多项式模型的非线性系数b2 或三次多项式模型的b2或b3中任一个与0比较 有显著差异 p 0 05 则该组数据存在非线性 t值表 34 35 举例 Ca的检测 实验室准备样本和对6个不同浓度水平的标本进行重复测定 假定实验室设定Ca的重复性和非线性误差均为0 20mg dL 从表中可以看出 没有明显的离群值 重复测定差值的SD为0 12 范围从0 6 到2 6 与标准相比 这个范围相对恒定 除此之外 也可通过随机误差评估对重复检测样品进行分析 36 表 回归分析的结果 回归分析显示二次多项式模型和三次多项式模型具有显著意义 三次多项式模型还有较低的标准差 较二次多项式和一次多项式模型有较好的适合性 37 线性偏倚分析 三次多项式和一次多项式模型的比较 差值从0 9到0 1 或12 到0 5 有五个浓度的差值超过实验室设定的误差水平 0 20mg dL 呈非线性 38 多项式回归修正 除去最后一个浓度点的数据 重新分析 39 二次多项式模型的回归系数b2有显著意义 t 3 8 2 365 DF 7 三次多项式模型的b2和b3无显著意义 标准差的大小也显示二次多项式模型较一次多项式和三次多项式模型更适合该组数据 一次多项式和二次多项式模型的差值都没有超过实验室设定的0 2mg dl 所以该方法在该范 4 65 15 4mg mL 内呈线性 线性偏倚分析 40 图C1 Ca线性实验 1 6稀释 图C2 Ca线性评价差值点图 1 6稀释 图C3 Ca线性实验 1 5稀释 图C4 Ca线性评价差值点图 1 5稀释 41 举例 在实验室内准备五个等距浓度的标本测定IgM 每标本重复测定两次 假定实验室设定的重复性和线性的允许误差范围分别为2 和5 随机顺序测试结果如下 从表中数据可以看出 没有明显的离群值 但在低水平浓度处重复性较好 而在高浓度水平处两次测量结果差异较大 重复性差异检测如下 42 表 回归分析的结果 从表中可知 二次多项式模型比一次多项式线性要好 有统计意义的显著性系数 t 5 7 超过查表的2 365 该组数据存在非线性 43 线性偏倚分析 从一次多项式和二次多项式模型的对比分析结果来看 在低和中浓度处有较大的差别 而在高浓度水平处有较好的一致性 高中低浓度水平处差值的百分数大小超过了实验室设定的误差范围 因而认为本方法不具有线性 44 样本测量时要按什么顺序 分析顺序应是随机的 但如果存在明显携带污染或漂移 则可妥协 重复测量的次数有具体要求吗 为了得到可靠的检测结果 对于某些分析物 或在某个浓度水平 需重复测量3 5次 用户要能准确地判断重复测量的次数 本指南不反对在不同的浓度水平重复不同的次数 评价线性范围时 最好要包含几个重要的浓度 a 最低分析浓度或线性