溶菌酶的制备实验PPT课件.ppt

溶菌酶的制备 3 4 8学时 溶菌酶的性质 溶菌酶 lysozyme 又称胞壁质酶 muramidase 或N 乙酰胞壁质聚糖水解酶 N acetylmuramideglycanohydrlase 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶 溶菌酶是一种碱性球蛋白 分子中碱性氨基酸 酰胺残基和芳香族氨 酸的比例较高 酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸 化学性质 白色或微白色冻干粉 溶于水 不溶于乙醚和丙酮 pI为11 0 11 35 最适pH值6 5 稳定性 酸性介质中可稳定存在 碱性介质中易失活 96 pH值为3条件下 15min后活力保持87 抑制剂有碘 咪唑和吲哚衍生物 表面活性剂 十二烷基硫酸钠 醇类和碳链不少于12的脂肪酸 1 水溶液在281 5nm处的吸光系数为26 4 生产方法 生产方法 以蛋清为原料 在pH6 5条件下 用弱酸性阳离子交换树脂732 724 吸附后 再用硫酸铵洗脱 经透析后冷冻干燥得产品 从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链 溶菌酶的作用机理 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶 它主要作用于肽多糖分子中N 乙酰胞壁酸与N 乙酰氨基葡萄糖之间的 1 4键 使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽 从而破坏细菌的细胞壁 导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解 失去对细胞的保护作用 最终使细菌溶解死亡 溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合 与DNA RNA 脱辅基蛋白形成复盐 使病毒失活 因此 该酶具有抗菌 消炎 抗病毒等作用 通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌 酶反应 菌悬浮液 溶菌并澄清 溶菌酶的用途 用途 用于生化研究 临床上用于急慢性咽喉炎 扁平苔癣 扁平疣等疾病的治疗 直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁 而达到杀菌的作用 这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成 其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白 这种多糖正是由N 乙酰胞壁酸与N 乙酰氨基葡萄糖之间的 1 4键联结的 对某些革兰氏阴性菌 如埃希氏大肠杆菌 伤寒沙门氏菌 也会受到溶菌酶的破坏 溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分 它能通过消化道而保持其活性状态 溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少 促进双歧杆菌的增加 还可以促进蛋白质的消化吸收 溶菌酶的特点 优点 1 溶菌酶是很稳定的蛋白质 有较强的抗热性 蛋清溶菌酶是C型 是已知的最耐热的酶 2 溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活 当转移到水溶液中时 溶菌酶的活力可全部恢复 3 溶菌酶可被冷冻或干燥处理 且活力稳定 4 溶菌酶适宜pH5 3 6 4 可用于低酸性食品防腐 5 溶菌酶生产成本较低 6 溶菌酶的抗菌谱较广 不仅局限于G 菌 对部分G 菌也有抑制效果 7 溶菌酶作为防腐剂安全性高 溶菌酶是一种天然蛋白质 1992年FAO WTO的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的 实验目的 掌握从蛋清中分离提取溶菌酶的工艺和方法 了解溶菌酶的物理化学性质 主要仪器设备和药品 1 耗材 pH试纸 500mL烧杯 100mL烧杯 玻璃棒 60 80目筛子 200mL量筒 滤纸 布氏漏斗 抽滤瓶 透析袋 pH试纸碱性 pH试纸酸性 50mL离心管 2 试剂 鸡蛋5个 724树脂50g 磷酸二氢钾 氢氧化钠固体 硫酸铵 浓盐酸 固体氯化钠 丙酮 磷酸二氢钾 3 仪器设备 电动搅拌器 冰箱 真空泵 真空干燥箱 4 溶液配制 1 0 15mol L pH6 5 磷酸缓冲液 取磷酸二氢钾6 8g 加0 1mol L氢氧化钠溶液152mL 用水至1定容到1L 即得 每组150mL 2 0 1mol L氢氧化钠溶液 4g氢氧化钠固体放入烧杯中 用800mL左右蒸馏水溶解 冷却后用蒸馏水定容至1L 即得 每组160mL 3 10 硫酸铵溶液 称取无水硫酸氨100g 用800mL水溶解 用蒸馏水定容至1L 即得 每组200mL 5 1mol L氢氧化钠溶液 40g氢氧化钠固体放入烧杯中 用800mL左右蒸馏水溶解 冷却后用蒸馏水定容至1L 即得 6 3mol L盐酸溶液 量取100mL浓盐酸加入300mL水中 混合均匀即得 实验方法 原料处理吸附去杂蛋白洗脱沉淀干燥盐析透析 方法步骤 1 制备蛋清 将4 5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞 使蛋清流出 鸡蛋清pH值不得小于8 轻轻搅拌5分钟 使鸡蛋清的稠度均匀 用铜筛过滤除去脐带块等其他杂质 量体积约为100mL 2 吸附 温度降至5 左右 边搅拌边加入处理好的724树脂50g 湿重 使树脂全部悬浮于蛋清中 保持0 5摄氏度 搅拌吸附5h 将蛋清在0 5 静置过夜 3 去除杂蛋白 把上层清液渐渐倒出 下层树脂用清水洗去吸附的蛋白质 反复4次 将树脂抽滤去水分 4 洗脱 取0 15mol L pH6 5 磷酸缓冲液150mL 分3次加入树脂中 搅拌约为15min 每次搅拌后减压抽滤去水分 用10 硫酸铵200mL 分4次洗脱溶菌酶 每次搅拌30min 过滤抽干 合并洗脱液 按总体积加入32 质量体积比 固体硫酸铵使含量达到40 有白色沉淀产生 冷却放置过夜 弃上清 沉淀离心分离 或抽滤 得粗制品 5 透析 将粗制品溶解于50ml蒸馏水 装入透析袋 0 5 透析24 36h 6 盐析 向澄清透析液中慢慢滴加1mol L氢氧化钠 同时不断搅拌 pH上升到8 5 9时 如有白色沉淀 立即离心除去 在搅拌中加入3mol L盐酸 使溶液pH达到3 5 按体积缓缓加入5 固体氯化钠 即有白色沉淀析出 在0 5 放置48h 离心或过滤得溶菌酶沉淀 7 干燥 沉淀加入10倍量 冷至0 的无水丙酮 不断搅拌 冷处静置数小时 用漏斗滤去丙酮 将沉淀置于真