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蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准 SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义 |0 . y6 t9 b 2 x1g固体酶粉在40和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。2 原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。! Y m& p q; I& K B& e$ T( B4 3.试剂和溶液3.1 1葡萄糖标准溶液（同葡聚糖酶酶活测定）3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠（粘度300600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml， 20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。4 C) c+ ( l2 R( M( p! L3.3 DNS 试剂（同葡聚糖酶酶活测定） ; h1 a. l3 Z3 k6 t2 |4仪器和设备4.1恒温水浴锅(400.2) 4.2分光光度计含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。 $ 1 h& A) p) K5测定步骤5.1 标准曲线绘制. * |! P6 u* G& u2 6 J4 Q 分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。1 H, % F/ 7 X/ U. W5.2待测酶液的制备（同葡聚糖酶酶活测定） 1 L- 5 h8 W; q+ V4 u2 Y5.3 比色测定精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40预热5min，加入经40预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。6.计算0 W+ i$ S: ( _1 o7 , R5 m( NX=cn/(0.5*10)式中：X样品的酶活力，u/g； c由样品的平均吸光度从标准曲线或回归方程求得的相对应的葡萄糖的量，mg；2 $ L4 s( $ f | $ | n样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g；0.5参与反应的酶液量，ml；! ?: E) 1 _& o1 T 10反应时间，min。 F _( U. V, J; M9 : G4 u+ l+ 空白对照液的配制：$ T, s4 B+ / & _: p( |* i( q(1)精确加入0.2ml稀释酶液。 (2)精确加入1.8 ml pH = 4.8醋酸缓冲溶液。(3)放入新华1号滤纸一条。(4)精确加入3ml DNS试剂。4 z Q% b; d7 - b5 _) j5 f(5)随同对照样，放入沸水浴中反应15min(注意：参见操作步骤6)。5 P b8 & |5 z0 v$ , (6)冷却后加入蒸馏水定容到25ml。1 l, ! G; p M0 Y6 K( D4 u9以空白对照液调零点，在max = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。# A8 ( C4 h e0 F7 Y滤纸酶活力 = A 5 200 1000 / 60 （u/g）A 吸光度值在标准曲线上对应的葡萄糖量（mg）。! Y6 1 v2 U8 P1 u5 W CMC酶（Cx）活力测定方法7 + V7 Z+ g. 0 w, M用pH = 4.8醋酸缓冲溶液配制1%CMC溶液。准确称取1g酶粉，用蒸馏水定容到2000ml，配制0.5g/L的稀释酶溶液。在有标准刻度线的试管中加入1.8ml1%CMC溶液。7 z, r0 w3 o( 再加入0.2ml稀释酶液。1 n; + . r& C; V8 W在501水浴中保温反应30min后，立即加入3ml DNS试剂。* m% R: d3 r$ I7 w空白对照液用1.8ml1%CMC溶液加入3ml DNS试剂，再加入0.2ml稀释酶液。同时在沸水浴中反应10min，加入蒸馏水定容到25ml。以空白对照液调零点，在max = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。, o/ R3 8 O4 j6 - b) p Cx酶活力 = A 5 2000 1000 / 30（u/g）全活性：取4支15ml试管，每支试管中加入1.5 mL.39预热的2%羧甲基纤维素钠（内含0.1 mg/mL硫柳汞），其中1号试管为试剂空白，加入0.01 M，pH6.8磷酸钠缓冲液1 ml； 2号试管为酶样空白，什么也不加；3,4号试管为酶样平行样，各加入1 ml酶液，4支试管同时放入39水浴回旋震荡培养60 min。培养后4支试管立即加入3 mL DNS（3,5-一硝基水杨酸溶液），再在2号试管中加入1 ml预先制备好的酶液，用旋涡震荡仪混匀后在开水浴中煮沸5 min，取出后用水冷却5min。以1号试管为空白，在紫外分光光度计上560 nm处进行比色。以D-葡萄糖作为标样，葡萄糖标准曲线的绘制：称取无水葡萄糖1.00g，溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为10 mg/mL葡萄糖溶液，再从中依次吸收1，2，3，4，5，6 ml各溶于100 mL容量瓶中，制成浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL溶液，吸取1.0 mL葡萄糖溶液加入3 mL DNS，煮沸5 min，冷却5 min于560 nm处比色，绘制标准曲线。Folin酚法测定蛋白酶活力一、原理采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。二、 试剂1) 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO22H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。4) pH值36醋酸缓冲液精确取NaAc3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。5) 2%酪蛋白底物缓冲液a) 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。b) 测试中性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL，在沸水浴中搅拌使其溶解，冷却后过滤，加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL，用去离子水定容至1000mL，即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。6) 100g/mL酪氨酸溶液精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。三、操作步骤1. 酪氨酸标准曲线的绘制取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0g/mL酪氨酸溶液做空白对照。管号标准酪氨酸(100g/mL)去离子水(mL)Na2CO3(mL)福林一酚试剂(mL)酪氨酸含量(g/mL)101.051020.20.8512030.40.6514040.60.4516050.80.2518061.0051100 2. 样品酶活的测定酶液适当稀释。取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmL pH 7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。四、蛋白酶活力计算蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。1.3.2 淀粉酶活性测定1.3.2.1 标准曲线的绘制分别吸取1.0葡萄糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的标准溶液，按表A1的操作步骤一起反应。以葡萄糖含量为纵坐标（0.5ml以上稀释液葡萄糖含量分别为：100、200、300、400、500、600g），以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程（Y=KX+B）。1.3.2.2 样品测定将各峰收集的样品经一定稀释后按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：表A1反应顺序样品，标准样品空白标准空白样品稀释液（ml）0.50.5蒸馏水（ml）0.550预热5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.5（第二步）1.5（第二步）混合50保温30min依次加入DNS试剂（ml）3.03.0（第一步）3.0（第一步）混合100煮沸7min（第一步）冷却蒸馏水（ml）101010混合均匀总体积（ml）15.015.015.0 反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶