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第一章 概述 第一节 生物分子提取和纯化一般过程1）材料的选择和保存 2) 破碎细胞(分别对待) 3) 抽提: 分离有效成分的过程4) 浓缩: 提高抽提液中有效成分浓度的过程5) 纯化: 去除其它杂质，提高有效成分纯度的过程6) 有效成分的干燥和保存纯化方案的评价 比活力 纯化倍数 得率 评价原则 1）总目标是增大纯化倍数和提高得率 2）若材料来源少，则要考虑得率;反之，考虑提高纯化倍数。第二节 生物分离技术的发展动态二、新技术的研究和开发1、新型分离介质的研究开发膜、树脂和凝胶是目前主要的新型分离介质2、子代分离技术(概念)各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透形成子代分离技术。具有较高的选择性和分离效率。 第三节 生物分离技术的设计和选择n 分离的本质在于有效识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物学性质的差别。n 物理性质：力学性质、热力学性质、电磁性质n 化学性质：化学热力学、化学反应学、光化学n 生物学性质：分子识别生物分离技术设计的基本原则1)、尽可能简单、低耗、高效、快速。2)、分离步骤尽可能少。Why? A)、 n -总回收率，n -各单元回收率。分离步骤越多，回收率越低；如10 = 0.9510 = 0.63，5 = 0.955 =0.77B)、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长。3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现。4)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。 5)、合理的分离步骤次序。 原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。思考题1、生物分子提取和纯化的一般过程？2、纯化方案的评价指标是什么？3、生物分离技术（纯化方案）设计的基本原则是什么？4、初步纯化与高度纯化分离效果有何不同？5、纯化生物产品的总收率是如何计算的？ 若每一步纯化产物的收率为90%，共6步纯化得到符合要求的产品，其总收率是多少？ 第二章 沉淀法 1、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。2、沉淀法的目的：通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。*3、沉淀法的原理( 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些条件就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。( 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，( 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。5、沉淀法的步骤 首先加入沉淀剂; 沉淀剂的沉化，促进粒子生长； 离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和沉化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。（7.8了解）7、沉淀法的应用沉淀法不仅可以用于实验室中；也可广泛用于生产的制备过程。因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。8、沉淀法的优缺点优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强。二、蛋白质的溶解特性防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 蛋白质周围的水化层。 蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。三、盐析1、概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。2、盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，（3）中和电荷，减少静电斥力， 3、盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象(salt-in)低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象(salt-out)高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。4、盐析用盐选择原则l 盐析作用要强l 盐析用盐需有较大的溶解度l 盐析用盐必须是惰性的l 来源丰富、经济5、硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法 2）加入饱和溶液法 3）透析平衡法。8、用盐析法分离蛋白质的二种方法（盐析法分为两类）第一类叫Ks分段盐析法，第二种叫分段盐析法，10、盐析的影响因素（简答）1）pH值2）温度的影响3）蛋白质浓度四、等电点沉淀法 1、定义和原理 在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。 不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。五、1、有机溶剂沉淀法定义 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。2、有机溶剂沉淀法机理A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 D水） B 破坏水化膜： C 相反力：六、 亲和沉淀1、定义：利用蛋白质与特定的配基（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。七、选择性变性沉淀法1、定义、原理概念：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。思考题1、什么是沉淀法，具体包括哪些方法？ 2、理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析3、盐析的机理是什么？ 4、影响盐析的因素有哪些？ 5、有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？6、用乙醇沉淀蛋白质时应注意哪些事项？7、何为选择性变性沉淀法？第三章 离子交换层析 第一节 基本原理概念：利用离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在离子交换剂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从离子交换剂上洗脱下来，达到分离的目的。原理：离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。 离子交换层析的固定相是离子交换剂，离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团、反离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。反离子是结合于电荷基团上的平衡离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。第二节 离子交换剂的分类及性质实用的离子交换剂应满足下列要求n 有高度的不溶性n 有疏松的多孔结构和巨大的比表面积n 有较多的交换基团n 有稳定的物理化学性质1、阳离子交换剂 阳离子交换剂中的电荷基团是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、 羧酸（COOH）和酚羟基（-OH）等酸性基团。2、阴离子交换剂 阴离子交换剂中的可解离基团是伯胺（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺-N (CH3)2和季胺-N(CH3)3等碱性基团。（二）亲水性离子交换剂n 常用的有纤维素(Cellulose) 、交联纤维素(Sephacel) 、交联葡聚糖(Sephadex) 、交联琼脂糖(Sepharose) 。n 引入电荷基团 G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克 （四）交换容量 指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。（七）流速 影响柱压，影响分辨率第三节 离子交换剂层析操作 （都要看 注意哪几方面）1、离子交换剂的选择选择离子交换剂的原则n 首先是阴阳离子交换剂的选择 n 其次是强弱离子交换剂的选择 n 然后是不同离子型交换剂的选择n 最后是不同载体离子交换剂的选择 阴阳离子交换剂的选择 取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷。如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂；如果被分离的物质为两性离子，则根据其稳定的pH范围所带的电荷来选择。例如：某蛋白质的pI为5，若在pH5-8稳定，则选择阴离子交换剂；若在pH5以下稳定，则选择阳离子交换剂。强弱离子交换剂的选择 一般来说，强性离子交换剂适用的pH范围广，常用来制备无离子水和一些在极端pH溶液中易解离且较稳定的物质。弱性离子交换剂pH范围窄，在pH中性的溶液中交换容量高，常用来分离生命大分子物质，确保不易失活。离子交换剂使用量的计算要根据离子交换剂全部交换交换量和待分离物质的总量来计算。当溶液中含有各种杂质时，必须考虑是交换量留有充分余地，实际交换容量只能按理论交换容量的25%-50%来计算，甚至更低。（10）举例：用717树脂分离200L含有2.2mol量的肌苷溶液，树脂的理论交换量为3.5mmol量/g，实际参与交换的树脂仅为理论交换量的7%，求需要717树脂的量。2.21000(3.57%)8900 g3、缓冲液的选择离子强度和pHu 保证各个待分离物质的稳定；u 使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；u 注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。6、洗脱n 改变溶液的pH或改变离子强度使用阴离子交换剂时，增加盐离子浓度，或降低pH值。使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，或升高pH值 n 洗脱方法（定义）阶段洗脱：分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。 缺点：由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。梯度洗脱：在同一个分析周期中，按一定程度连续不断地改变洗脱液的浓度配比进行洗脱。 在一定时间内，不同形式的梯度液流经层析柱某点累积体积时的浓度C，可用公式计算：C=CB-（CB-CA）(1- V2/V1 )CB：B瓶浓度CA：A瓶浓度V2：流经层析柱体积V1：洗脱液的总体积举例：n 离子交换层析中，以0.1-0.5mol/L的NaCl梯度的缓冲液洗脱（总体积200ml，梯度瓶直径相同），通过层析柱75ml时， NaCl浓度是多少？0.5-(0.5-0.1)(1- 75/200 ) =0.25mol/L7、洗脱速度n 洗脱速度通常要保持恒定n 洗脱速度慢比快的分辨率好n 如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。 第四章 凝胶过滤层析 第一节 凝胶层析的基本原理n 概念 凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析、立体排阻层析、体积排阻层析，是利用具有立体网状结构、且呈珠状颗粒的凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。n 原理1 ) 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙向前移动，速度快而首先流出层析柱，因此流程较短；2 ) 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，从一个胶粒孔隙进入另一凝胶颗粒，移动速率慢而最后流出层析柱；3)中等大小的分子，在凝胶颗粒内外均有分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。凝胶层析的几个概念外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。t+ 计算法：Vt = 1/4 pD2h测量法：t+ 由于 非常小，可忽略不计，因此：t+可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如蓝色葡聚糖-2000；i可用硫酸铵等无吸附力的小分子物质。分配系数: 分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。 排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量。第二节 凝胶介质的分类和性质葡聚糖凝胶 （类型） G类葡聚糖（Sephadex） LH-亲脂型葡聚糖 Sephacryl琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶第三节 凝胶层析基本操作 （仔细看）一、凝胶的选择n 凝胶型号的选择n 凝胶粒度的选择n 不同凝胶类型的选择n 凝胶用量的计算（1）凝胶型号的选择（根据分离的目的）组别分离，将样品中的大分子物质与小分子物质分开。脱盐就是一种组别分离。 其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。 策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。（2）粒度的选择 目数（mesh颗粒直径的大小）。目数越大，直径越小。 每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。u 细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢，适合小型实验。层析柱选用大直径的；u 粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验，选用小直径的柱子提高分辨率。（4）凝胶用量的计算三、 凝胶柱的制备1）柱的选择 长层析柱分辨效率高于短柱。理想的直径和长度之比是1：251：100第五章 亲和层析 第一节 亲和层析基本原理亲和层析定义 亲和层析是通过生物分子之间特异可逆结合与解离的原理，进行生物分子特异分离的层析技术。三、亲和吸附剂的制备n 溴化氰偶联法包括步骤：活化 偶联 封闭过剩活性基团 配体结合量的计算五、分离大分子物质n 亲和力较小时，可连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。n 亲和力一般时，主要改变缓冲液的性质(如改变pH值或离子强度)，使复合物之间的亲和力降到足以分离的程度。n 亲和力较大时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白质变性剂洗脱。思考题1、什么是亲和层析？其原理是什么？2、亲和层析时，优良的配体应具备什么条件？3、亲和层析特异性吸附的影响因素有哪些？4、亲和层析操作洗脱时，根据亲和力大小的不同，如何选择洗脱液？第六章 电泳第一节 电泳概述什么是电泳？电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。电泳的分类：显微电泳 自由界面电泳 区带电泳 区带电泳的共同特点 ：1