植物细胞工程.doc

一、组织培养：是一种将植物的组织器官或细胞在培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术。愈伤组织：植物组织在离体状态下培养，给一定条件使已经分化并停止生长的细胞重新分裂分裂生长而形成没有组织结构的细胞团。植物细胞全能性：植物的每一个细胞都具备该物种的全套遗传信息和发育成完整植株的能力。去分化：改变细胞的结构与功能，而恢复到愈伤组织状态。根据外植体的来源，植物组培分为：1植株培养2胚胎培养3器官培养4组织或愈伤组织培养5细胞或原生质体培养植物组织培养的应用：1基础理论研究方面：遗传背景一致的条件下，根芽发育的相关性，春化作用等。2植物的遗传育种方面胚胎的培养应用培育三倍体植株花药花粉培养进行单被体育中经细胞融合得到细胞杂种种质资源保存3生产上优良品种的快速繁殖培育无病毒植株次生物质工业化生产2、 实验室设计与基本设备1化学试验室（准备室）平面实验台、超声波清洗器、水箱、厨具、电子天平、磁力搅拌器、酸度计、全自动高压灭菌锅2无菌操作室（接种室）面积不宜过大，严格无菌严禁灰尘3培养室，无菌，温度光照温度可控。4高压灭菌室5细胞学实验室培养基成分及作用：1水2无机盐，大量微量元素3活性因子，离子4有机化合物，碳源，提供能源，维持渗透压 维生素，以辅酶形式参与代谢，氨基酸，有机氮源5植物生长调节物质，生长素，诱导细胞分裂和根的分化，细胞分裂素，促进细胞分裂分化茎的增殖6天然复合物7其他成分，固化剂，活性炭，吸附作用。3、 植物离体微繁技术：是利用植物组培方法快速繁殖植物材料，以在短期内遗传性一致的大量再生个体技术。特点：1繁殖率高2占用空间少3培养条件可控性强4管理方便，便于种质保质和交换应用：稀少，名优品种或资源的快速繁殖植物离体微繁技术一般包括哪几个阶段，分别注意哪些事项？1无菌培养物的建立2诱导外植体的生长和分化3促进中间繁殖体的增殖4壮苗和生根5试管苗出瓶种植与苗期管理6试管苗增值率的仿算植物的再生方式分为四种：1顶芽和腋芽的发育2不定芽的发育3体细胞胚的发生与发育4原球茎的发育在离体微繁中主要存在的问题：褐变 、试管苗的玻璃化、菌类污染褐变：由于组织中的多分氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生棕褐色的醌类物质，他们会逐渐扩散到培养基中，抑制其他酶的活性，毒害培养的外植体材料。影响褐变的因素：1基因型差异，分类物质含量和多酚氧化酶活性的差异2材料的生理状态和取材时间3培养基成分4其他因子影响：外植体大小和培养时间。克服褐变的措施：1选择适当的外植体和培养条件：分生能力强，低盐2抗氧化剂的作用3其他防止褐变的措施：连续转移，低温处理。试管苗的玻璃化：持有的一种生理失调或生理病变。形态学特征：1植株矮小肿胀，茎尖顶端分生组织相对较小，节间短或几乎没有2叶片水渍化呈半透明，厚而狭长3叶片缺柔韧性生理化特点：1细胞含水量高2叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素等含量低3一些酶的活性发生变化4内源激素水平发生变化玻璃花苗的综合控制：1选择合适的外植体，（对逆境忍受力强，顶芽）2改善培养基组分3改善培养条件无糖微繁技术：指在一个相对大的培养空间，采用人工环境控制手段，用CO2替代糖作为碳源，提供植株生长适宜的光、温、水、气、营养等条件，促进植株的光合作用，从而促进植株增殖，生长和发育的技术。4、 植物脱毒的方法：1热处理2茎尖培养3通过愈伤组织培养消除病毒1热处理：在高于正常温度下，病毒被部分或完全钝化，但很少甚至不伤害寄主植物.热处理方法分为：温汤浸渍法；热空气处理法2茎尖培养：脱毒依据：病毒在植物体内分布不均匀的，顶端无毒或毒性很低。脱毒原理：没有维管系统不利于病毒移动；旺盛分裂的分生细胞代谢活性高，病毒无法复制；具有使高活性病毒钝化系统；存在高水平内源生长素抑制病毒增殖技术关键：茎尖大小A同一病毒在不同植物体内分布部位不同B不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同C茎尖越小对培养基和剥离技术的要求越高，成功率约低剥离方法：表面消毒，解剖针解剖刀；防止茎尖变干，可带叶原基，也可以不带影响脱毒效果的因素：培养基、外植体大小、培养条件、外植体生理状态3通过愈伤组织培养消除病毒：愈伤组织的平均性，病毒复制速度落后于细胞增殖速度，细胞突变获得了抗病毒的特性脱毒效果的检验：1生物鉴定法：对病毒极为敏感，一旦感染病毒，将在叶片乃至全株表现特有的病斑2电子显微镜法：直接观察叶片检查，病毒质粒的存在与否，测量病毒质粒的大小，形状和结构3抗血清鉴定法4RT-PCR法5、 植物胚胎培养：是指对植物的胚(种胚)及胚器官(如子房,胚珠)进行人工离体无菌培养,使其发育成幼苗的技术.植物胚培养的目的意义：1远缘杂交中胚挽救2打破种子休眠3诱导胚状体和胚性愈伤组织4稀有植物繁殖离体幼胚培养的生长发育方式：1正常胚发育途径：形成成熟胚2早熟萌发：不继续胚性生长，而在培养基上迅速萌发成畸形幼苗3脱分化形成愈伤组织：距离胚性器官越近的组织分化能力越强离体授粉：指在离体条件下对雌蕊的柱头，带胎座的胚珠和单个胚珠进行人工授粉和完成受精并形成种子的过程离体受精：游离的植物精细胞和卵细胞融合形成合子，进一步培养使其形成完整植株的技术离体受精三种方式：离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉6、 植物细胞培养：在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，另离体植物细胞生长繁殖的方法植物细胞培养的应用：1理论研究：细胞代谢，各种不同物质对细胞的影响2植物天然化合物生产：生产细胞，初级和次级代谢产物3生物转化：利用植物培养细胞为酶源，使某种前体化合物生成相应产物的技术4体细胞无性系变异和细胞突变体筛选5遗传转化的基础材料分离植物细胞：1从外植体直接分离植物细胞A机械法B酶解法2从愈伤组织获取植物细胞悬浮细胞培养的目的：建立一种细胞增殖速度快，有用成分含量高，分散程度大的游离细胞悬浮物悬浮细胞培养的做法：A从已建立的愈伤组织中挑选外观疏松生长快的愈伤组织B用震荡或酶解法游离出单个细胞或小细胞团C接种在固体培养基上，培养约两周D挑选生长快的细胞株并继代培养E取各细胞系的培养物测定有效成分，筛选出有效成分高生长快的细胞株同步培养：在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段参数：在某一时刻，处于细胞周期某一点上的细胞百分数7、 酶解法分离原生质体的酶液组成：1酶2渗透稳定剂3含-SH的保护剂4PH缓冲剂原生质体的纯化：1过滤离心法A过滤收集滤液B低速离心3-5分钟，取沉淀悬浮后重复3-5次。2漂浮法原生质体培养基：1含有高浓度甘露醇2Ca、Mg离子增加3大量元素浓度低4广泛使用2,4-D 5碳源以葡萄糖较好最可靠6氮源NH4不宜过高，硝酸盐有毒害作用原生质体融合：脱壁植物细胞（或细菌细胞）通过物理、化学等因子的诱导，两个原生质体合并在一起形成融合细胞的过程。诱导融合方法：1离子诱导融合法2高Ca-高PH值法3PEG法4电刺激诱导融合体细胞杂交过程：原生质体制备-原生质体融合-杂种细胞选择-杂种细胞培养-杂种细胞再生植株-杂种细胞鉴定融合产物：1亲和的细胞杂种2部分亲和的细胞杂种3胞质杂种8、 植物花药培养：离体培养植物花药组织，通过诱导花药中小孢子的雄核发育，产生单倍体，通过染色体加倍产生加倍单倍体的技术。雄核发育：小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株的过程花药培养获得单倍体的一般程序：1取材2预处理3消毒4接种和培养5花粉植株的诱导6壮苗和移栽7单倍体植株的二倍化人工加倍：用秋水仙素1浸泡花粉植株2处理腋芽3加入到培养基中4处理分蘖芽9、 植物细胞无性系变异：指植物的组织、细胞、原生质体在离体培养的条件下所得的培养物及再生植株的变异无性系变异的特点：1是一种广泛存在的现象2变异涉及的性状广泛3是可遗传的，能够通过有性或无性过程进行传递4无性系变异的频率高低与外植体的来源及培养时间长短有关系5变异幅度达但畸变频率低，单个或少数基因变异占较大比例，一般再生植株二代基因可以得到稳定，同时还有隐性性状活化的特点提高无性系变异的方法：1延长愈伤组织继代培养的时间2提高继代培养基中激素浓度3变温处理正筛选法：指把细胞群体置于某种选择剂或选择条件下，使突变体可以生长，而正常型细胞不能生存而死亡负筛选法：培养条件只能使正常细胞生长，突变体受抑制不分裂生长细胞突变体的类型：营养缺陷型细胞突变体、抗病