报告基因系统的研究进展cropped.doc

综述其它专题综述报告基因系统的研究进展沙新平 综述胡国龄 审校(中南大学湘雅医院传染病研究所 ,长沙 410008)摘 要 :综述氯霉素转乙酰酶 ( CA T) 、2半乳糖苷酶 (2gal) 、2葡萄糖苷酸酶 (p2GU S) 、分泌型碱性磷酸酶 ( SEA P) 、荧光素酶 (luc) 、绿荧光蛋白 ( GF P) 等报告基因系统研究与应用进展 ;简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和 优缺点 。关键词 :氯霉素转乙酰酶报告基因 ; 2半乳糖苷酶报告基因 ;分泌型碱性磷酸酶报告基因 ; 绿荧光蛋白报告基因 ; 荧光素酶报告基因中图分类号 : Q756文献标识码 :A文章编号 :100623730 (2003) 0120026203法用于报告基因的测定如 : 比色法 (colorimet ry) 、荧光法 (fluo2rescent) 、生物发光法 ( bioluminescent) 、化学发光法 ( chemilumi2nescent) 、酶联免疫法 ( EL ISA) 及原位染色法 (in sit u staining) 及 流式细胞仪法3 。2 报告基因的种类2 . 1 氯霉素转乙酰酶报告 基 因 ( chlormnp henicol acetylt rans2 ferase ,CA T) 细菌的 CA T 酶能将乙酰基从乙酰辅酶 A 转移 到氯霉素上 ,而使其失去抗菌性 。该反应能通过测量放射性标 记的底物而量化 。放射性同位素标记底物有3 H 标记的乙酰辅 酶 A 和14 C 标记的氯霉素或荧光素标记的其中之一 。CA T 抗 体因可以用于 EL ISA 法检测 CA T ,所以也广泛用于该反应的 检测 ,虽然 CA T 的测定只能用细胞提取物进行 ,且测定的范围 很窄 ,且可能有放射性同位素的污染 ,而限制了它的应用 ,但由 于它在真核细胞中的本底很低 ,结果的重现性很好及灵敏度很 高 ,而在进行表达的改变的研究中仍广泛应用 。目前有很多著 名公 司 生 产 有 CA T 分 析 系 统 的 商 品 试 剂 盒 。如 Amersham Pharmacia Biotech 公司曾经生产 (2002 年的产品目录上已经不 存在了 !) 的 Quan2T2CA TTM Assay System ,该试剂盒检测3 H 标 记的乙酰辅酶 A 和生物素标记的氯霉素 ,使用者只需用试剂 盒提供的链亲和素包被的聚苯乙烯株俘获氯霉素 ,再通过液闪 法测定放射性计数 ,即可计算出 CA T 活性 。据称 ,该方法的灵 敏度是14 C 为底物方法的 30 倍 。作为改进 St ratagene 公司的 Pat hDetect t rans2reporting systems 试剂盒可有多种报告基因选 择 ,如 CA T , hr2GF P , SEA P 等 ,且提供一种高转染率的受体细 胞 ,最大的优点是能进行反式转录因子的测定 ,且灵敏度高 、本 底小及检测方法简单 。Pro mega 公司也生产有 p CA T 3 全套 试剂盒 ,与该公司既往生产的同类载体相比 ,适当改变了多克 隆酶切位点 ,使其更加易于插入目的片段 。另外 ,该试剂盒的 CA T 分析法 ,有放射性同位素标记和荧光素标记两种选择方 法 。在研究基因功能的过程中 ,不可避免地要研究基因的调控机制 ,基因的表达产物非常复杂而难以对其定量和定性 。要在 细胞的生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难 。但研究者发现了一种简单的研究基因调控的方法1 即报告基因分析系统 。报告基因分析系统的发现给基因的调控 与表达的研究带来了新的希望 ,短短的几年 ,报告基因系统的研究也取得了快速的发展 ,本文将对报告基因的研究进展做一 综述 。1报告基因的研究背景对真核基因的调控的了解 ,主要来自野生型和突变型的假 定顺式作用调控元件的活性测定实验 ,这些实验是在转染的真 核细胞中进行的 。转录的起始点 ,可以通过对 mRNA5端在模 板 DNA 中的确切位置进行作图来决定 , 这些技术包括 : 引物 延伸 分 析 、DNA : RNA 杂 交 体 的 S1 核 酸 酶 消 化 以 及 RNA : RNA 杂交体的 RNA 酶 A 消化等 。但直接测定 RNA 的丰度及 结构 ,有一个大的问题 : 由于需要纯化并通过杂交和电泳来分 析各种不同的 RNA ,将是一个很大的工程 。因此 ,在大多数情 况下不直接测定调控元件的调节转录速率的能力 ,而是把顺式 调控元件与一种编码新的产物的 ,被称为报告基因的基因序列 连接起来 ,在基因的转录过程中 ,测定报告基因的转录产物的 量 ,来判断顺式调控元件的调控能力 。虽然这是一个间接的方 法 ,但却是一种可行 ,而且有时是唯一的方法 。作为报告基因 必须具备以下特点 :1 . 由原核基因编码的基因产物必须与同转 染前真核细胞内任何相似的产物相区别 ;2 . 细胞内其它的基因 产物不会干扰报告基因产物的检测 :3 . 报告基因编码的产物的 检测应该快速 、简便 、灵敏度高而且重现性好2 。到目前为止 , 报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相 连 ,先让质粒在大肠杆菌中进行增殖 ,再提取质粒 ,转染入感兴 趣的真核细胞中 。与此同时还要将一有真核启动子和增强子 的另一种报告基因质粒 ,共转染同一细胞 ,以作为转染率的内 对照 。在转染后的适当的时间内 ,检测报告基因的 mRNA 、编 码的蛋白质或编码的酶的活性 。通常检测这些产物需要破坏 细胞 ,但也可以通过原位杂交或细胞培养物上清液来检测 ,甚 至活细胞通过流式细胞仪进行检测 。理想的检测方法应该是 灵敏 、简单 、安全 、经济 、快速和重现性好 。选择何种报告基因 系统应根据研究的目的 ( 基因表达调控或转染效率的测定 ?) 、 组织与细胞的类别 、信号检测的时间性与空间性 ( temporal ver2 sus spatial) 以及首选的检测方法 ,如 :组织化学法 ( histochemical staining) 、液 闪 法 ( 1iquid scintillo met ry ) 、分 光 光 度 法 ( spec2t rop hoto met ry) 、发光计法 ( 1umino met ry) 。目前已有很多的方2 . 2 2半乳糖苷酶报告基因 (2galatosidase , 2gal) 4由大肠杆菌编码的2gal 能水解乳糖为半乳糖 。虽然在很多细菌 、植物和动物细胞中存在较高的本底 ,而限制了它的使用 ,但还是 常常用做转染的参照体系 。通过使用特定的方法 ,还能够区别内外源性的2gal (主要是改变缓冲液的 p H 至 8 . 0) ,有公司生产有专 门 的 试 剂 盒 来 区 分 内 源 性 与 外 源 性 的 2gal 如 ICNBio medical 公司既往生产 ( 2002 年产品目录未列) 的 Aurora TMGa I2XE kit 。有很多种方法来检测2gal :比色法 (colorimet ric) 、荧光法 (fluorescent ) , 及 化 学 发 光 法 ( chemiluminescent ) 。大 致原 理 为 2gal 水 解 ON P G ( o2nit rop henyl22D2galactoside ) 或CPR G(chlorop henol red2D2galactoside) 产生颜色的改变 , 而能被分光光度计所检测 ,在原位组化中2gal 能水解 X2gal ( 52bro2mo242chloro232indoyl22D2galactop yranoside) 产生蓝色的沉淀 ,或将底物改为荧光素源物质如 MU G(2met hyl umbelliferyl galac2toside) 及 FD G (fluorescein digalactoside) 而 能 在 显 微 镜 下 观 察 到 。另外 ,Molecular Probes 公司的 Fluo Report r lacZ Flow Cy2to metly Kit s 试剂盒及 Mar ker Gene Technologies 公司的 in vivolaeZ2galactosidase Detectio n Kit 试 剂 盒 均 能 用 流 式 细 胞 仪(flow cyto met ry) 或共聚焦显微镜进行快速检测 。但 FD G 做为 底物有一个缺点 , FD G 及其荧光水解衍生物 , 在生理条件下 , 很快从细胞中排出 。为解决此缺点 M GT 公司将试剂盒加上一冷冻的步骤 。很多公司为此改进了试剂盒的操作步骤 ,或加 入细胞稳定剂如 t hiol2reactive chloro met hyl group ,该基团能与 半胱氨酸或细胞内的巯基基团结合形成肽一荧光素结合物 ,使荧光染 料 不 易 很 快 被 排 出 细 胞 。Ima Gene Green 与 lma Gene RedlacZ Gene Exp ressio n Kit s 均用含 12 个碳原子的亲脂性基 团结合荧光素 ,使亲脂性的“尾巴”结合在细胞膜上 ,而不易被 排出 。另外还有的公司使用化学发光法检测2gal 如 AppliedBiosystems 的 Galacto2Light TM and Galacto2Light PlusTM kit s 。Novagen 公 司 也 生 产 有 fluoro met ric Beta FluorTM b2Galactosi2daseAssay 其灵敏度达 500f g 。2 . 3 2葡萄糖苷酸酶 (2glucuro nidase , 2GU S) 报告基因 5GU S 为大肠杆菌的又一水解酶 ,它能水解葡萄糖苷酸 。该报告基因主要用于缺乏该酶的病毒性植物病原体 、植物 、酵母 、及 真菌等的研究中 , 在医学研究中相 对 应 用 较 少 。ICN 公 司 的Aurora GU S 试剂 盒 可 以 用 于 植 物 和 动 物 细 胞 的 报 告 基 因 分析 。另外 该 试 剂 盒 中 应 用 了 MU G ( 42met hylumbelliferyl22D2 glucuro nide) 使实验的灵敏度比同类的荧光分析更加灵敏 ,且能 使存在动植物细胞中的荧光本底降低很多 。2 . 4 分泌型碱性磷酸酶 ( secreted al kaline p hosp hatase , SEA P)报告基因7 ,8 。 该酶为人胎盘碱性磷酸 酶 ( human placentalal kaline p hosp hatase , PL A P) 的突变体 ,也有从北大西洋海域中的耐热细菌中分离出耐热型 A P 。由于该酶能由表达细胞分泌 到细胞外 ,而被最近的研究者认为最具有前途的一种报告基因 ,近年来 对 此 的 研 究 也 较 多7 、8 。由 于 该 酶 能 分 泌 到 细 胞 外 ,在检测时 ,可以在不破坏细胞的情况下 ,任意时间都可以取细胞培养上清液进行重复的 ,动态的检测 ,且被检测细胞还可以用做其它的用途 。由于 SEA P 为 PL A P 的突变体 ,使其具有 了耐热特性 ,而且在 L2高精氨酸 (L2ho moarginine) 存在下也具有不变的活性 。这样 ,只要将培养物经热处理和在反应体系中 加入 L2高精氨酸 , 就可以彻底将内源性的 A P 灭活 。AppliedBiosystems 公司的 Phosp ha2Light TM kit 使用一种被称为 CSPD 的底物 ,能检测到低达 10 - 21 摩尔的 SEA P 酶 。ICN 公司的Aurora A P kit ,BD Biosciences2CL ON T ECH 的 Great EscA PeTM Reporter System 均能采用荧光分析和化学发光分析方法检测 到超低浓度的 SEA P 。蛋白来 稳 定 光 子 的 发 射 ; Roche Molecular Biochemicals 的 L u2ciferase Gene Assay 使用辅酶 A 使光子发射稳定数分钟 ; Roche的 L uciferase Assay wit h Co nstant Light Signal 中使用 AM P 使 信号 半 衰 期 长 达 3 h ; Packard Bio Science 公 司 的 L ucLite and L ucLite Plus ,Co nstant2QuantaTM reporter gene assays 称因“使用长命型光 信号”( 10ng2lived“glow”2t ype signal) ,而使其半衰期 长达 5 h 。值得一提的是 Pro mega 公司的 Dual2L uciferase Re2 porter Assay System 将萤火虫荧光素酶与海三色堇 ( seapansy ,Renilla reniformis) 荧光素酶的优点结合起来 ,建立了单管双报告酶的分 析 体 系 , 使 其 具 有 内 参 照 系 统 而 检 测 基 因 的 表 达 。Renilla 荧光素酶的结构与萤火虫荧光素酶的结构完全不同 ,可使 用 coelenterazine 为 底 物 , 使 用 Pro mega 公 司 提 供 的stop & Glo Reagent 能使萤火虫荧光素酶失活而使 Renilla 荧光 素酶激活 :AppliedBiosystems 的 Tropix Oual2Light assay 提供 使荧光素酶与2gal 在同一管内相继检测的方法 ,且在检测方法简单 、快速的同时并未使方法的灵敏度和测定范围值下降 。2 . 6绿 荧 光 蛋 白 ( green fluorescent p roteins , GF P) 报 告 基因11 13该 基 因 来 源 于 西 北 太 平 洋 海 域 的 水 母 ( Aequoreavictoria) 。该蛋白在紫外光下发射荧光 ,而可以被多种方法检测 。该报告基因检测不需要底物 ,基因产物2绿荧光蛋白在加 热 、变性剂 、去垢剂及一般的蛋白酶均不能使它灭活 。另外 ,该蛋白的可用荧光显微镜或荧光激活的细胞分类系统 ( FACS) 进 行检测 ,该报告基因还有一重要优点即能在活细胞条件下观测 ,而且能进行细胞内的定位分析 。因为野生型的 GF P 无放 大作用 ,故比荧光素酶的灵敏度低 。目前已有很多公司将野生型的 GF P 进行基因工程改造 ,使其荧光更亮 、能发出不同颜色 的荧光以及可表达在细胞的不同部位 。GF P 基因还能在转基因小鼠中以无害的形式整合于小鼠的 DNA 中 。当然有些种类 的 GF P 因对细胞有毒 ,而使其在细胞中不稳定 。St ratagene 公 司从海三色堇 ( R. reniformis) 提取 GF P 的 cDNA 建立了低毒性的人性重 组 GF P , 使 其 能 在 细 胞 中 因 其 低 毒 性 而 稳 定 表 达 。CP G 公司的 A F P2TagTM vectors 是一种能与插入的目的基因产 生融合蛋白的标记载体 ,它能发出蓝 、绿色荧光 。红色转换型GF P 与蓝色荧光蛋白是 GF P 的突变体 ,它们均能在不同的激发光下发出不同颜色的荧光 ,因此而能被分别检测 。由于绿色 和蓝色荧光蛋白的光谱不相重叠 , 所以 A F P2Tag 载体能被单 独或一起使用 。由于该荧光蛋白具有稳定的自身荧光现象 ,所以可在活细胞或固定后的细胞中进行观察 ,且可在细菌或真核 细胞中都能表达 。Qbiogene 公司的 Super Glo TM GF P 与 Super2Glo B F P 证明提高激发光的峰值 ,使其发射光谱用荧光共振能 量转移技术 (fluorescence reso nance energy t ransfer , FR E T) 进行活细胞内的荧 光 的 观 察 。BD Biosciences2CL ON T ECH 公 司 的 构建了一种报告基因质粒 (Living ColorsTM Fluorescent Timer) ,在插入的目的启动子随着时间而失活时 ,其颜色也由绿色变为 红色 。为了提高检测的灵敏度 , Heim 等14 人 将 GF P 发 光 结构中的 Set 65 用 Thr 替代 , Phe64 用 L eu 替代 ,使荧光的强度提 高了 35 倍 ,而且在激发后的 1624 h 仍可稳定地检测到荧光 ,此外 ,还用人源性较好的密码子替代野生型中的密码子 ,而大大提高了在哺乳细胞中的兼容性 ,这些改变使得 GF P 的检测 灵敏度提高了很多 , Clo ntech 公司的 p E GF P 系列就是该类报告基因质粒 。该公司的另外一个试剂盒 Living ColorsTM HcRed采用从 reef coral Heteractis crispa 提取的有色蛋白基因 ,并进行 突变改装 ,做为报告基因 ,该基因编码的有色蛋白为非荧光蛋 白 ,不需要发色辅助物质 ,且发光光谱峰值在 618nm ,为红光 ,极易与背景光分开 ,而能被流式细胞仪高效率分辩 。3 报告基因的特殊应用随着报告基因的快速发展 ,某些特殊用途的报告基因质粒 载体已经被很多的生物技术公司进行类商品化的生产 ,而很方 便地用 来 研 究 。如 St ratagene 公 司 的 Pat hDetect cis2reporter22 . 5 荧光素酶 (luciferase ,luc) 报告基因9 ,10该酶克隆于北美洲萤火虫 ( Photinus p yralis) 的荧光素酶基因 ,它能催化甲虫的荧光素的氧化性羧化作用 ,发射出光子 ,能被光度计或闪 烁 计数器捕获定量 。由于荧光素酶分析具有快速 、方便 ,更具有很好的浓度线性范围 (具有 78 个数量级的线性范围) ,而被 广泛应用 。另外由于荧光素酶能在合成时与蛋白产生融合蛋 白 ,以及该酶的检测灵敏度达 10 - 20 mol ,且该酶的半衰期很短 ,在评价基因的表达物的诱导效应的瞬间分析中具有较好的效 果 。在既往的检测中 ,要求光密度计具有一自动探头 ,能在加底物的 0 . 3 秒内测量出光子发射的峰值 。现在的方法已经有 了很大 的 改 进 , 在 化 学 反 应 中 通 过 降 低 反 馈 抑 制 ( reducingfeedback inhibitio n) 而使信号更加稳定 ,使其检测可以用液闪法 或光照度计法进行检测 。如 Per kin Elmer Life Sciences 的 Wal2lac GeneL ux kit ,应用 dit hiot hreitol ,p yrop hosp hate ,及牛血清白版社 ,1999 ,8022812 .L ewis J C. Applicatio ns of reporter genesJ . Anal ytical Chem2ist ry ,1998 ,70 (17) :5792585 .Lim K , Chae CB . A simple assay for DNA t ransfectio n by in2 cubatio n of t he cells in cult ure dishew wit h subst rates for2 galatosidase J . Bio Techni ques ,1989 ,7 (6) :5762579 .Zezulak M , Snyder JJ , Needleman SB . Simultaneous analysis of codeine , morp hine , and heroin af ter B2glucuro nidase hy2 drolysisJ . J Forensic Sci ,1993 ,38 (6) :127521285 .Wang M , Orsini C , Casanova D , et al . MU SEA P , a novel reporter gene for t he st udy of lo ng2term gene exp ressio n in im2 munoco mpetent mice J . Gene ,2001 ,279 (1) :992108 .Hauksso n JB , Andresso n OS , Asgeirsso n B . Heat2labile bac2terial al kaline p hosp hatase f ro m a marine Vibrio sp J . En 2zyme and Microbial Technology ,2000 ,27 (122) :66273 .Funk CJ . Al kaline p hosp hatase activity in whitefly salivary glands and saliva J . Arch Insect Biochem Ph ysiol , 2001 , 46 (4) :1652174 .Amido n WJ , Pfeil J E , Gal S. Modificatio n of luciferase to be a subst rate for plant aspartic p roteinase J . Biochem J , 1999 ,343 (p t 2) :4252433 .L eclerc GM , Boockfor FR , Faught WJ , et al . Develop ment of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene exp ressio n J . Biotechni ques , 2000 , 29 ( 3 ) : 59021 , 5942596 .Prasher DC , Eckenrode V K , Ward WW , et al . Primary st ruct ure of t he Aequorea victoria green fluorescent p rotein J . Gene ,1992 ,111 (2) :2292233 .Cormack B . FACS2op timized mutant s of t he green fluorescentp rotein ( GF P) J . Gene ,1996 ,173 (1 Spec No) :33238 .Ozawa T , Nogami S , Sato M , et al . A fluorescent indicator for detecting p rotein2p rotein interactio ns in vivo based o n p ro2 tein splicingJ . Anal Chem ,2000 ,72 (21) :515125157 .Heim R , Tsien R Y. Engineering green fluorescent p rotein for imp roved bright ness , lo nger wavelengt hs and fluorescence res2 o nance energy t ransfer J . Curr Biol ,1996 ,6 (2) :1782182 . Casey J L , COley AM , Tilley L M , et al . Green fluorescent antibodies : novel in vit ro tools J . Protein En g ,2000 ,13 ( 6) :4452452 .(2002204221 收稿 2002207208 修回)本文编辑 :杨庆华plasmids 该报告基因带有一启动子和增强子 ,能启动荧光素酶或 GF P 的表达 ,常用于研究基因的顺式转录元件的研究 。同 样 , BD Biosciences2CL ON T ECH 开 发 了 MereuryTM Pat hwayProfiling Systems 它还能帮助研究者研究与信号转导如 ,炎症 、细胞分化 、P KC 与钙通道信号及压力反应 。每一系统都包含 有一系列的含有不同启动子的质粒如 p53 反应元件 ,糖皮质激素反应元件 , 或 E2 FDNA 结合元件及 SEA P 、d2 E GF P 或荧 光素酶 报 告 基 因 。St ratagene 公 司 的 Pat hDetect t rans2reporting systems 可以让研究者研究目的基因是否会影响如 c2J un 的 N末端激酶 (J N K) 、有 丝 分 裂 原 激 活 的 蛋 白 激 酶 ( MA P K) 、c2AM P 依赖的激酶 ( P KA) 、或 p38 激酶的活化通路 。该系统通 路特异的反式报告质粒能编码如 CA T 、2gal , SEA P ,luciferase ,或 hr GF P 。Thermo L absystems 公 司 以 Gene Therap y Systems( GTS) 为 基 础 开 发 的 PNA 依 赖 的 基 因 化 学 ( PNA2dependem gene chemist ry) 被 认 为 是 一 种 新 的 、独 特 的 报 告 基 因 。PNA (pep6de nucleic acids) 为一类寡核苷酸类似物 ,能序列特异性地与靶 DNA 杂交结合 ,如质粒 。同时还能与其配体 、荧光素 、抗 体结合 ,使与其结合的 DNA 一起形成复合物 。于是 ,目的基因即可被插入 p Gene Grip TM vector 上的多克隆位点 ,而修饰成报 告基因 ,并连接上被荧光染料罗丹明 ( r hodamine) 、荧光素 、生物素或马来酰亚胺 ( maleimide) 标记的 PNAs 。因 为 连 上 的 标 记为荧光基团或功能性多肽 ,所以对研究 DNA 的分布及功能来说 ,会变得很简单了 。表达 GF P 、2gal 、荧光素酶及 SEA P 报告基因的载体以及用 PNAs 标记的连接物均已商品化 。Heim345678910报道15将 E GF P 报告基因与表达单链抗体可变区 ( single2chainantibody variable f ragment , sc Fv) 的 基 因 相 连 结 , 构 建 出 可 与HBsAg 特异反 应 的 绿 荧 光 抗 体 , 可 直 接 用 于 HBsAg 的 检 测 。 另外 , Yang 等报道 ,将 E GF P 基因结合到特异性蛋白质表达基因上 ,而表达融合蛋白 ,将此融合蛋白做为蛋白激酶的底物 ,通过水解底物后荧光颜色及强度的改变的检测 ,能提高蛋白激酶 反应的灵敏度 。报告基因技术随着时间的推移 ,而被广泛应用到高产量药物的筛选 、基因治疗实验 、以及生物传感器的构建以及基因的 调控与功能的研究中 。而其报告基因的种类及检测的方法 、灵敏度 、特异性均会得到很大的发展 。参考文献1 Groskreutz D , Schenborn E T. Reporter systemsJ . Met hods in Molecular Biology ,1997 ,63 :11230 .2 J . 萨姆布鲁克 , E. F. 弗里奇 , T. 曼尼阿帝斯主编 ,金冬雁 ,黎孟枫等译 M . 分子克隆实验指南 . 第二版 . 北京 :科学出1112131415(上接第 23 页)9 Lit ynska A , Prybylo M , Po