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免疫组织化学试题参考答案免疫组织化学试题参考答案 一 名词解释 一 名词解释 1 PAS 反应反应 即过碘酸 雪夫反应显示糖原 简称 PAS 反应 其原理是通过利用过碘酸的氧化作用 使糖分子中的二醇基氧化为二醛基 释放出醛基 与碱性品红反应 生成紫红色化合物沉淀 2 Feulgen 法法 即福尔根反应显示 DNA 法 其原 理是组织用 1NHCl 60 水解 将 DNA 分子中脱氧 核糖核酸与嘌呤间的连链打开 使之释放出醛基与 碱性品红发生反应 生成紫红色化合物沉淀 3 PAP 法 法 即过氧化物酶一抗过氧化物酶法 该技 术原理与其他免疫定位技术相同 即通过抗体使标 记分子 抗辣根过氧化物酶 定位于抗原附件 其 不同点为三步法 且有放大作用 反应完全依赖于 免疫学结合 不需要标记任何抗体 反应灵敏度高 背景低 注意一抗与复合物中的抗体必须来源于同 一种动物 且二抗必须过剩 4 核酸探针核酸探针 指能与特定核酸序列发生特异性互补 的已知标记的核酸片段 可检测待测样品中特定的 基因序列 无标记的探针称裸探针 5 核酸分子杂交核酸分子杂交 指具有互补序列的两条核酸单链 在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程 杂 交的双方分别为待测的核酸序列和已知核酸序列 后者通常用核素或非核素示踪标记 称为探针 probe 杂交后形成的异源双链分子称为杂交分 子 6 质量控制质量控制 指组织化学反应各环节中获得最佳效 果的技术把握 是组织化学的关键环节 是取得满 意效果的必要条件 是提高结果可信度的根本保 证 7 诱发荧光诱发荧光 组织细胞中的某些物质本身不发荧 光 但在经过一定的化学反应后可以转变成荧光分 子 此技术目前主要应用在生物胺的显示中 其中 最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺 去甲肾上腺 素 肾上腺素和 5 羟色胺荧光 以及邻苯二醛诱 发组织胺荧光的反应 8 定量分析定量分析 定量判断是结果判断中最重要也是具 有意义的判断 其判断结果有助于统计学的分析处 理 组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细 胞化学 指在组织细胞化学阳性结果的基础上 对 阳性结果 最终阳性产物 进行测量 以数值反应 被检测物质的含量 此法是阳性结果的进一步检测 和分析 更加直观地反应实验结果 更有力地说明 实验结果 常用有人工定量分析与仪器定量分析两 类 9 固定固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结 构 防止组织自溶 有必要对细胞和组织进行固定 其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固 终止或抵制外 源性和内源性酶活性 更重要的是最大限度的保存 细胞和组织的抗原性 使水溶性抗原转变为非水溶 性抗原 防止抗原弥散 10 组织化学组织化学 指在形态学基础上研究组织或细胞 中物质的化学成分和活性 并进行定性 定位 定 量及其代谢状态的学科 其目的是联系形态 化学 万分和功能来了解组织或细胞的代谢变化 11 ABC 法法 即亲和素 生物素 过氧化物酶复合物 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 法 其基本原理是在抗生物素和生物素之间形成共 价和不可逆的结合 通过抗生物素在辣根过氧化物 酶和第二抗体之间建立生物素桥联 使酶定位于所 需测定的特异性抗体周围 其优点在于易于找到合 适的第二抗体 12 细胞骨架细胞骨架 指细胞内的结构网架 由一些细丝 成分组成 包括微丝 微管 中间丝和微梁网格 二 问答题二 问答题 1 简述酶组织化学的基本原理 简述酶组织化学的基本原理 答 在酶组织细胞化学方法中 从原理上讲 可分 为两在类型 一类是酶是活性 酶组织细胞化学 方法 属于一般组织细胞化学方法 一类是酶蛋白 质的存在及存在的部位 免疫酶组织细胞化学 方法 属于免疫组织细胞化学的内容 目前 通常 是将两者结合起来 即显示酶活性 又酶蛋白的存 在 分布及代谢情况 2 用箭头表示免疫电镜技术 包埋前法 的过程 用箭头表示免疫电镜技术 包埋前法 的过程 答 包埋前法实用于酶标法和 PAP 法 具体过程 如下 取材 固定 冰冻切片 40 150 m 免疫染色 同酶标法和 PAP 法 选择 阳性部位 在解剖显微镜下 取下阳性部位 裱于 盖玻片上 1 的锇酸固定 1 1 5h 脱水 平 板 包 埋 聚合 修块 超薄切 片 50 80nm 裱于铜网 重金属盐双重染色 电镜观察 记录 照片 3 简述核酸分子原位杂交组织化学的过程 简述核酸分子原位杂交组织化学的过程 答 此过程包括 杂交前准备 取材和固定 玻 片及盖片的处理 粘附剂的使用 器皿处理和溶 液配制容器的处理 增加组织的通透性和核酸探 针的穿透性 减低背景染色 防止 RNA 酶的污 染 杂交过程 杂交反应 包括变性与杂交 杂交后处理 冲洗 用一系列浓度不同的和温度 不等的平衡盐液冲洗 一般原则是盐液的浓度由高 到低 温度由低到高 并在冲洗的过程中防止切 片干燥 RNA 酶消化处理 仅使用于 RNA 杂交 显示 杂交体的检测 同位素标记者 用放射 自显影技术显示 非同位素标记者 应选择相应 的方式显示 对照实验 根据核酸探针和靶核苷 酸的种类在现有可能条件下选定 4 组织化学质量控制有哪些方法 组织化学质量控制有哪些方法 答 组织化学质量控制的方法有 实验过程的质 量控制 试剂的质量控制 包括 试剂的特异性 和敏感性 最佳的稀释度 在已知阳性和阴性的标 本上 观察其染色结果的复合情况 要确定染色的 温度和时间 保存的时间和有效期的时间 操作 步骤的质量控制 包括 组织标本制备的质量控制 操作过程各环节的质量控制 a 各种溶液的浓度 成分 PH 值的控制 容器的质量标准 b 特殊试 剂的配制 c 步骤中间环节的控制 背景染色 的控制 疏水作用 离子作用 电荷作用 内原 性酶活性作用 抗体污染或 抗体纯度不高 内原 性抗生物素 生物素蛋白结合活性 抗原的扩散 交差反应 其它原因 5 比较比较 PAP 法和法和 ABC 法的异同 法的异同 PAP ABC 灵敏性灵敏性 低 1 倍 高 20 倍 特异性特异性 高 更高 背景背景 一般有背景 一般很少或无背景 复合物特点复合物特点 PAP 复合物 只用于 PAP 法 且抗体与一抗的种族相同 ABC 复合物 用途广 可通用 用生物素标记的均可 用途用途 免疫组织化学 IHC IHC ELISA 原位杂交 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 6 简述简述 PAP 法的过程 法的过程 答 处理切片 封闭内源性物质和避免交叉反应 抗孵育切片 湿室 37 30 60 分钟 PBS 漂洗 3 次 5 分钟 次 2 抗孵育切片 湿室 室温 37 30 60 分钟 PBS 漂洗 3 次 5 分钟 次 加入 PAP 复合物 孵育 30 分钟 PBS 漂洗 3 次 5 分钟 次 染色 0 01 0 02 H2O2 0 01 0 05 DAB 0 05 0 10UMTris Hcl PH7 40 室温 3 5 分钟 避光 漂洗 双蒸馏水洗涤 复染 漂洗 双蒸馏 水洗涤 脱水 透明 封片 光镜观察 记录 7 定量分析有哪些方法 定量分析有哪些方法 答 人工定量分析 仪器定量分析 显微荧 光分光光度计 显微分光光度计 仪 显微图 像分析仪 灰度 长度 周边 面积 曲线长等 流式细胞计数仪 激光扫描共聚焦显微镜技 术 8 增强组织化学染色的方法有哪些 增强组织化学染色的方法有哪些 答 酶消化在抗原暴露中的作用 胃蛋白酶 0 4 37 20 30 分钟 胰蛋白酶 0 1 37 5 40 分钟 链霉蛋白酶 0 06 室温 10 分钟 微波炉处理在暴露抗原中的作用 其 原理在于通过微波管发射较高频率的电磁波而使 组织内部的分子发生高速振荡 使组织温度升高 同时加速分子交联 促使组织中抗原决定簇暴露 步骤 脱蜡 水化的标本微波处理 10 20 分钟 功率600W 室温冷却15分钟以上 常规免疫细胞 化学染色 不同抗原组织准备方法的检测 主要 在固定方法和固定剂上存在差异 细胞外和基底 膜相关蛋白抗原 交联固定剂碳二亚胺和蛋白沉淀 类固定剂乙醇 细胞膜和胞浆相关免疫球蛋白 首选蛋白沉淀类固定剂乙醇 胞浆酶和胞浆激 素 醛类固定剂 各类组织和细胞抗原 低浓度 的多聚甲醛 4 5h 4 固定后直接进行冰冻切片 9 简述结果的判断的类型及意义 简述结果的判断的类型及意义 答 结果的判断类型 定性判断 即实验结果真 实性判断 定位判断 即结果出现的部位的确定 可以协助定性判断 定量判断是结果判断中最重 要也最具有意义的判断 意义 实验结果的判断直 接关系着实验的成败 因此 结果判断是整个实验 工作的核心和结论 必须是真实的结果 特别是一 些实验结果与前人或与其它文献报道差异较大时 作出结果判断时应特别慎重 10 简述核酸原位杂交技术的特点 简述核酸原位杂交技术的特点 答 核酸原位杂交技术的特点如下 特异性与敏 感性高 在组织细胞内定位可检测的靶序列 能够将组织学表现与基因功能的变化相结合 可 完好的保存组织与细胞的形态结构 不需要从组 织细胞中提取核酸 避免了抽提中核酸量的损失 对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性 可在 1 细胞中检出目的核酸序列 可用于研究 个别细胞中的核酸 而不受组织中其他细胞的影 响 不需要破裂细胞 经适当处理后探针可进入 细胞 与细胞内核酸杂交 11 用箭头表示石蜡切片技术的步骤 用箭头表示石蜡切片技术的步骤 答 石蜡切片技术步骤 取材 固定 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 12 简述免疫组织细胞化学技术的全过程 简述免疫组织细胞化学技术的全过程 答 免疫组织细胞化学技术全过程 抗原提取和纯 化 免疫动物 抗体的分离 提取 纯化和 效价的确定 标记抗体 标本制备 免 疫反应过程 观察及结果判断与分析 13 常见的免疫组织化学方法有哪些 常见的免疫组织化学方法有哪些 答 常见的免疫组织化学方法 免疫荧光组织 细胞化学技术 免疫酶标组织 细胞化学技术 过氧化物酶一抗过氧化物酶法 PAP 法 抗 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 生物素 生物素复合技术 ABC 法 SPA 免疫 组织 细胞化学技术 免疫电镜技术 14 影响核酸杂交的因素有哪些 影响核酸杂交的因素有哪些 答 影响核酸杂交的因素 核酸分子的浓度和长 度 核酸浓度大 单链核酸间的碰撞几率大 复性 几率大 单链探针浓度越大 杂交效率高 但双链 探针浓度过高会影响杂交的效率 温度 温度过 高不利于核酸的复性 温度过低不利于少数碱基配 对形成的局部双链分离 离子强度 离子强度低 杂交速度慢 随着离子强度增高杂交反应率增加 杂交液中的甲酰胺 甲酰胺是一种变性剂 能干 扰碱基堆积力和氢键的形成 因此可减低核酸杂交 的 Tm 核酸分子的复杂性 核酸的复杂性是指 存在于反应体系中不同顺序的总长度 复杂性越 高 形成正确配对难度越大 反应速度越慢 非 特异性杂交反应 为减少非特异性杂交反应 在杂 交前将非特异性杂交位点进行封闭 以减少对探针 的非特异性吸附作用 15 简述核酸分子原位杂交的基本原理 简述核酸分子原位杂交的基本原理 答 核酸分子杂交是依据 DNA 双链碱基互补 变 性和复性的原理 用已知碱基序列的单链核酸片段 作为探针检测样品中是否存在与其互补的同源核 酸序列的方法 即双链核酸分子 DNA 双链 分 子分解为单链 变性 采用加热 提 PH 值来实现 杂交后单链聚合为双链 退火 复性 16 简述组织化学的基本要求 简述组织化学的基本要求 答 组织化学的基本要求 保持组织细胞良好的 形态结构 具备高度的特异性 应有一定的灵 敏性 可重复性 生物反映的产物必须在原位 沉淀 色深 不溶和具有稳定性的特点 17 简述免疫组化在人体研究中的主要用途 简述免疫组化在人体研究中的主要用途 答 免疫组化在人体研究中的主要用途 免疫组 化在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用 1 组织起源不明肿瘤的研究 2 研究病原体与肿瘤 的关系 3 协助确定肿瘤的良恶性 4 测定肿 瘤细胞的增殖活性 5 分化差的癌和肉瘤的鉴别 6 确定转移性恶性肿瘤的原发灶 7 恶性淋 巴瘤的诊断和分型 8 为制定肿瘤的治疗方案提 供依据 免疫组化技术在病原微生物的鉴定中的 应用 免疫性皮肤疾病在诊断中的应用 三 填空题三 填空题 1 影响酶催化反应的因素是 酶浓度 底物浓度 激活剂浓度 抑制剂浓度 PH 值 温度 2 核酸杂交的一般步骤是 待测核酸的制备与变性 探针的制备及标记 固相支持物的选择与处理 预杂交 杂交 漂洗 检测显示杂交信号 结果 的判断分析 3 增强特异免疫染色的方法有 蛋白酶消化法 合适的抗体稀释液 温育的时间长短 30 60 4 过夜 多层染色 提高敏感度 4 常用的固定剂是 醛类 非醛类 金属类 5 核糖体是核糖核酸和蛋白质组成 6 抗体常用的标记物有荧光素 酶 抗生物素 生 物素 HRP 金属 7 根据探针的核酸性质分基因组 DNA 探针 cDNA 探针 RNA 探针 寡核苷酸探针四类 8 仪器定量分析技术有显微荧光分光光度计 显微 分光光度计 仪 显微图像分析仪 流式细胞计数 仪 激光扫描共聚焦显微镜技术 9 组织化学的基本要求是保持组织细胞良好的形 态结构 具备高度的特异性 应有一定的灵敏性 可重复性 生物反映的产物必须在原位沉淀 色深 不溶和具有稳定性的特点 10 石蜡切片的 5 大步骤是 取材 固定 脱 水 浸蜡 包埋 切片 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 11 组化中常用的酶类 辣根过氧化物酶 HRP 小牛肠碱性磷酸酶 CIAP 葡萄糖氧化酶 半乳糖苷酶 12 固定基本原则是组织块要尽量小 固定要及时 和适时 选择合适的固定剂 要注意固定剂的浓度 PH 值和温度 13 固定方法是 浸入法 和 灌注法 14 免疫组织 细胞化学特点是高度特异性 高度敏 感性 方法和过程统一 形态 机能 新陈代谢等 生命活动相结合 15 核酸原位杂交技术的特点是 特异性 敏感性高 可检测的靶序列在组织细胞内 定位 能够将组织学表现与基因功能的变化相结 合 可完好的保存组织 细胞的形态结构 不需要 从组织细胞中提取核酸 避免了抽提中核酸量的损 失 对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感 性 可在 1 细胞中检出目的核酸序列 可用于研 究个别细胞中的核酸 而不受组织中其它细胞的影 响 不需破裂细胞 经适当处理后探针可进入细胞 与细胞内核酸杂交 16 内质网分 粗面内质网 和 滑面内质网 两类 17 根据试剂或标记物的不同分 一般组织化学 荧 光组织化学 免疫组织化学 核酸分子原位杂交组 织化学 四类 18 核糖体分 游离核糖体 附着核糖体 多聚核糖 体 三类 19 溶酶体分 初级溶酶体 次级溶酶体 残余体 三 类 20 细胞骨架是微丝 微管 中间丝 和 微梁网架 组成 21 确定最适 PH 的方法是查阅文献 根据前人的经 验 预实验印证和实验测定最适 PH 值 22 实验过程的质量控制是试剂的质量控制 操作 步骤的质量控制 背景染色的控制 23 在酶组织化学中 根据其反应原则 显示酶的 方法 可分为 沉淀反应法 和 电子传递法 两大 类 24 辣根过氧化物酶 HRP 显色原有 DAB AEC CN H Y 试剂 25 荧光组织化学分为自发荧光 诱发荧光 荧光 染色 免疫荧光 酶促荧光 26 荧光图象的记录方法有描述法 荧光照相 暴 光时间测定法 强弱表示法 显微荧光测定法 27 免疫反应的形成可分致敏阶段 反应阶段 和 效应阶段 三个阶段 28 PAP 法的特点是抗体活性高 灵敏度高 背景 染色浅 有利于观察和记录 29 ABC 法的优点是 敏感性强 特异性强 背 景染色浅 方法简单 节约时间 ABC 试剂 盒国内已大量生产 价格适中 生物素具有与多 种显示剂结合的能力 可用作双重或多重免疫染 色 30 免疫电镜技术的基本要求是保持超微结构完 好 结构不改变 保存最多的抗原及抗原活性 31 免疫电镜技术分铁蛋白标记免疫电镜技术 酶 标记免疫电镜技术 PAP 法 和 胶体金免疫电镜技 术 四类 32 胶体金免疫电镜技术优点是 金颗粒电子密度 高 清晰可辩 形态规则 方法简单一些 不如 PAP 法复杂 同一组实验 可用不同直径的金颗 粒可作多种抗原的区别研究 双标 金标抗体能 发生二次电子 可作用扫描电镜观察 33 免疫电镜技术包埋后法缺点是 抗原及活性损 失大 部位不准 得到阳性结果难度大 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 四 实验设计题四 实验设计题 一 某实验室拟采用 ABC 法研究缺血性心肌损 伤时 ANP ANF 的变化 请设计此课题 1 准备哪些试剂和药品 二甲苯 30 H2O2和浓盐酸 ABC 免疫复合物试 剂 抗大鼠 ANP 的特异性兔抗体 一抗 生物素 标记羊抗兔免疫球蛋白 二抗 正常羊血清 PBS 液 DAB 显色剂 梯度酒精溶液 100 95 90 80 70 蒸馏水 磷酸盐缓冲液 PBS 复染液 如苏木精 封片剂 中性树胶 等 2 写出实验的思路或过程 实验动物与分组 取大鼠 同种 同窝别 相近 体重 20 只 随机分为 2 组 实验组 缺血组 10 只 对照组 10 只 实验组大鼠采用结扎冠状动脉方法制作缺血性 心肌损伤模型 对照组 即假手术组 只暴露冠状 动脉但不结扎 实验过程 从实验组大鼠心肌损伤组织中按设 计好的不同时间点取材 对照组取材部位 时间与 实验组相同 制备石蜡切片标本 石蜡切片脱 蜡下水 3 H2O2室温避光封闭 20min 蒸馏水 洗 TBS 微波修复抗原 0 01mLMPBS 洗 3min 3 次 正常羊血清 37 孵育 20min 甩干不 洗 兔抗 ANP37 孵育 1h 0 01MPBS 洗 3min 3 次 生物素化羊抗兔 IgG37 孵育 30min 0 01MPBS 洗 3min 3 次 加 ABC 复合物 37 孵育 30min 0 01MPBS 洗 4min 4 次 DAB 室 温避光显色 5 10min 镜下控制显色时间 自来 水终止 10切片脱水 透明封片 实验组与对照组均按上述实验过程进行 观察记录结果 出现棕黄色颗粒即为阳性结果 将实验组与对照组比较 用统计学方法分析 得 出结论 二 某实验室拟采用 PAP 法研究缺血性脑损伤 时 NPY 的变化 请设计此课题 1 准备哪些试剂和药品 二甲苯 30 H2O2和浓盐酸 PAP 免疫复合物试 剂 来自于兔 抗大鼠 NPY 的特异性兔抗体 一 抗 猪抗兔免疫球蛋白 二抗 正常猪血清 PBS 液 DAB 显色剂 梯度酒精溶液 100 95 90 80 70 蒸馏水 磷酸盐缓冲液 PBS 复染液 如苏木精 封片剂 中性树胶 等 2 写出实验的思路或过程 实验动物与分组 取大鼠 同种 同窝别 相近 体重 20 只 随机分为 2 组 实验组 缺血组 10 只 对照组 10 只 实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全 脑缺血性动物模型 对照组 即假手术组 只暴露 颈总动脉但不结扎 实验过程 从实验组大鼠大脑皮质组织中按设 计好的不同时间点取材 对照组取材部位 时间与 实验组相同 制备石蜡切片标本 石蜡切片脱 蜡下水 3 H2O2室温避光封闭 20min 蒸馏水 洗 TBS 微波修复抗原 0 01mLMPBS 洗 3min 3 次 正常猪血清 37 孵育 20min 甩干不 洗 兔抗 NPY37 孵育 1h 0 01MPBS 洗 3min 3 次 猪抗兔 IgG37 孵育 30min 0 01MPBS 洗 3min 3 次 加 PAP 复合物 37 孵育 30min 0 01MPBS 洗 4min 4 次 DAB 室温避光显色 5 10min 镜下控制显色时间 自来水终止 10 切片脱水 透明封片 实验组与对照组均按上述实验过程进行 观察记录结果 出现棕黄色颗粒即为阳性结果 将实验组与对照组比较 用统计学方法分析 得 出结论 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 三 某实验室拟采用核酸原位杂交技术研究缺血 性脑损伤时 SPmRNA 的变化 请设计此课题 1 准备哪些试剂和药品 二甲苯 30 H2O2和浓盐酸 梯度酒精溶液 100 95 90 80 70 蒸馏水 复 染液 如苏木精 封片剂 中性树胶 0 1M PBS pH7 2 0 2M PB pH7 2 0 1M 甘氨酸 4 多 聚甲醛 16 Denhardt 溶液 预杂交液 20 SSC 抗体稀释液 TSM1 DIG DNA 标记检测试剂盒 2 写出实验的思路或过程 实验动物与分组 取大鼠 同种 同窝别 相近 体重 20 只 随机分为 2 组 实验组 缺血组 10 只 对照组 10 只 实验组大鼠采用结扎双侧 颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型 对照组 即假手术组 只暴露颈总动脉但不结扎 实验过程 麻醉大鼠后 用 4 多聚甲醛灌流 固定后取材 制备冰冻切片 随机引物制备 cDNA 核酸探针 并用 DIG DNA 标记检测试剂盒 检测探针敏感性 预杂交 滴加适量预杂交液 42 30 min 杂交 倾去预杂交液 在每张切 片上滴加 10 20 l 杂交液 将探针变性后稀释在 预杂交液中 0 5 ng l 覆以盖玻片或蜡膜 42 过夜 注意阴性对照 洗片 4 SSC 2 SSC 1 SSC 0 5 SSC 37 各洗 20min 0 2 SSC 37 洗 10min 0 2 SSC 与 0 1M PBS 各半 洗 10min 0 05M PBS 洗 5min 2 次 3 BSA 0 05M PBS 包被 37 30min 滴加抗地高 辛 抗血清碱性磷酸酶复合物 以抗体稀释液 1 5000 稀释 4 孵育过夜 0 05M PBS 洗 15min 4次 TSM1 10min 2次 新鲜配制TSM2 10min 2 次 显色 在玻片上滴加适量显色液 4 避光过夜 将玻片置于 TE 中 10 30min 以终止 反应 酒精梯度脱水 二甲苯脱脂 中性树胶封片 实验组与对照组均按上述实验过程进行 观察 记录结果 出现棕黄色颗粒即为阳性结果 将实验组与对照组比较 用统计学方法分析 得 出结论 四 某实验室拟采用免疫电镜技术 包埋前法