单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改.doc

单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1收稿日期 ：基金项目 ：国家质量监督检验检疫总局科技项目（2010IK269）；宁波市农业科研攻关合作项目 (2008C10014)；宁波市自然科学基金项目（2010A610018）作者简介 ：王江岭（1982），男，河南开封人，助理农艺师，硕士，主要从事检疫性植物病原线虫的检测鉴定. E-mail : 通讯作者 ：顾建锋（1972-），男，浙江余姚人，高级农艺师，大学本科，从事检疫性植物病原线虫及真菌的检测鉴定. TelE-mail : .（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1Ningbo Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo 315012; 2Jiaxing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Jiaxing 314000）Abstract There are many problems in extracting DNA from large number of nematodes. The nematodes could be a mixed specie. The extracted DNA were decreasing in experiment process. Amplification might be cumbered by adding more solutes, and even to effect on the next experiments. In this method a single nematode was freezed by liquid nitrogen and heated at 85 to disrupte the structure of nematode cells by changing the temperature suddenly. Then the proteins were dissolved easily by proteinase K and more DNA were extracted., This method was proved effective, rapid, and stabile by kinds of nematodes. the PCR result is good even when the extracted DNA were diluted for 32 time. Compared with two other proteinase K methods, to extract nematode DNA, this method was proved effective, rapid, and stabile, and could be used in rapid test. Nematode proteins were dissolved quitely and released more DNA. More chances to do molecular experiments were provided. The advantages of this method are: (1) PCR Buffer attached to Taq enzyme take the place of WLB and SDS lysis liquids, which reduces the instability of reaction system and the effect of added solutes. (2) All the process is finished in one PCR tube, no liquid transported and less solutes added. So the pollution and bad effect to the later PCR process are greatly reduced. (3) Manual disruption of nematode is replaced by poikilothermic treatment,; and the effect of pollution is avoided and no experiment technique is required. Compared with two other proteinase K methods of nematode DNA extraction, this method was proved effective and stabile, and could be used in rapid test; nematode proteins were dissolved completely and more DNA released, the PCR result is good even when the extracted DNA were diluted for 32 time, which procides more molecular experiments chances.Key words nematode, optimized method, DNA, proteinase K, temperature摘 要: 大量线虫DNA的提取可能因线虫不纯而受到污染，溶液多次转移造成DNA提取量减少损失，并且在提取过程中加入过多的溶质离子也可能对PCR扩增有干扰，从而影响下一步的研究。本研究用液氮快速冷冻单条线虫，继以85快速变温，用温度的剧烈变化使线虫裂解，再以蛋白酶K降解蛋白质，提高了获得的DNA的纯度和数量。通过多种线虫的验证试验表明，该方法高效、快速、结果稳定、可靠、高效。该试验方法有如下优点：(1)使用Taq酶附带的PCR Buffer代替WLB裂解液和SDS裂解液，减少了配置的不确定性和外来离子的影响。(2)整个提取过程在一个PCR管中完成，并可直接用于PCR扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添加，减少污染和对后续PCR的影响。（3）使用变温处理代替其他手工破碎方法，减少了外界污染物的掺入，不需要手工操作技巧。与另外两种提取线虫DNA的蛋白酶K方法相比，本研究提取单条线虫DNA的时间短，效率高，PCR扩增结果稳定可靠，符合快速检测的需求；此外，本研究的所使用的方法降解单条线虫蛋白质彻底，提取DNA数量多，稀释32倍仍能扩增出明显的条带，可进行多次分子试验研究。关键词: 线虫 方法优化 DNA 蛋白酶K 温度中图分类号 : S763 文献标识码 ：A由于线虫体形较小，形态学鉴定十分困难，分子生物学方法已成为十分有效的辅助手段，而其基础是单条线虫DNA提取。近年来，许多学者曾尝试用碱裂解法1-3、蛋白酶K法4-9、试剂盒法10等进行单条线虫DNA提取,但存在实验时间长、所用试剂多、价格贵、结果不稳定等问题。本实验室在蛋白酶K方法的基础上，利用温度的急剧变化提高提取效果，并对蛋白酶K的处理时间进行了优化，使利用单条线虫制备的DNA可进行32次PCR反应，而且操作简单、结果稳定。1 材料与方法1.1 供试线虫试验选用16种线虫，分别为属伞滑刃属Bursaphelenchus、滑刃属Aphelenchoides、外真滑刃属Ektaphelenchus和鲁姆滑刃属Ruehmaphelenchus见表1。表1 线虫来源编号种类来源编号种类来源30697松材线虫B. xylophilus美国2349鲁姆滑刃属线虫R. sp.台湾9452拟松材线虫B. mucronatus乌克兰3334雄双滑刃线虫A. stammeri西班牙01148食菌伞滑刃线虫B. fungivorus印度尼西亚6311滑刃属线虫A. sp.比利时00175小角伞滑刃线虫B. corneolus台湾8503滑刃属线虫A. sp.日本8907豆伞滑刃线虫B. doui韩国020K滑刃属线虫A. sp.香港22138弗氏伞滑刃线虫B. fuchsi荷兰6996滑刃属线虫A. sp.美国38717拟小刺伞滑刃线虫B. paraparvispicularis香港52340滑刃属线虫A. sp.瑞典9123外真滑刃属线虫E. sp.美国37002滑刃属线虫A. sp.韩国1.2 3三种方法提取单条松材线虫DNA PCR扩增比较1.2.1 制备单条线虫DNA的3种三种方法方法1：线虫放入ddH2O清洗，挑取单条放入200 L PCR管中（含8 L ddH2O和1 L 10PCR Buffer（Mg2+ free），液氮中放置1 min，85加热2 min，向PCR管中加入1 L 1 mg/mL蛋白酶K，56加热15 min，95加热10 min，得到DNA提取液直接进行PCR扩增。方法2：参考沈锡权（2005）11。单条线虫放入预先加有20 L ddH2O的离心管中，-84冷冻过夜，室温融化后加入2 L 10倍PCR缓冲液和2 L蛋白酶K（20 mg/mL），混合并简单离心，55温浴2-3 h，95 30 min。方法3：参考王金成（2005）8，在灭菌的洁净载玻片上加15 L灭菌的超纯水，用3号针将单条线虫挑入水滴中，切成2-3段，吸取12 L含有所有线虫的双蒸水，加入200 L PCR管中，加入1.5 L 10PCR Buffer，1.5 L蛋白酶K（1 mg/mL），-80冷冻至少30 min，65温育60 min，95 10 min。1.2.2 PCR 扩增PCR扩增采用50 L反应体系：10PCR Buffer （Mg2+ free）5 L，25 mM MgCl2 5 L，0.1 mM dNTP 4 L，10 M 上游引物F19412（5-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3）3 L，10 M下游引物5368r13（5-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3）3 L，5 U/L Taq酶0.6 L，DNA提取液（3种三种提取方法得到的全部DNA提取液），ddH2O补齐50 L。扩增程序：94 4 min；94 40 sec，52 1 min，72 1.5 min，36个循环；72 8 min。1.2.3 处理设置分别用3种三种方法提取单条松材线虫DNA，每方法设10个重复。提取获得的DNA直接PCR扩增，并电泳拍照。1.3 方法1和方法2对线虫蛋白质降解比较用方法1和方法2分别对10条松材线虫进行DNA的提取处理，并在处理结束后吸出线虫全部提取液在显微镜下检查。1.4 单条线虫DNA梯度浓度PCR扩增取2条松材线虫，按照方法1用20 L提取液提取DNA。继而取出10 L提取液进行PCR扩增，剩余10 L提取液分别梯度稀释为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，稀释后各取10 L进行PCR扩增，电泳拍照。1.5 方法1提取多种线虫DNA PCR扩增用方法1分别提取1.1中除松材线虫外其他线虫DNA，PCR扩增，并电泳拍照。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MaM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MbcM为DL2000 Marker，泳道1-10为单条松材线虫，a 方法1，b 方法2，c 方法3图 1 3种三种方法提取单条松材线虫DNA PCR扩增结果2 结果与分析2.1 3种三种方法提取单条线虫DNA PCR扩增比较根据PCR扩增条带的亮度，由图1可看出：单条线虫DNA提取方法1 PCR扩增条带亮度清晰、均一，扩增效果稳定，且明显优于方法2和方法3；方法2 PCR扩增条带亮度一般且不稳定；而方法3提取成功率不高，还出现了非特异性条带，说明在处理线虫的过程中有可能受到了污染。2.2 方法1和方法2对线虫蛋白质降解比较从图2可以看到，方法1更有利于蛋白酶K发挥作用，且基本降解了线虫的蛋白质；而方法2不能完全降解线虫的蛋白质，甚至还有完整的线虫存在，不能保证得到大量线虫DNA。这也证明了该方法提取线虫DNA没有方法1高效。a b ca方法1，b、c 方法2图 2 2种两种提取单条线虫DNA方法对线虫组分溶解情况M 1 2 3 4 5 6 7 MM 为 DL2000 Marker，泳道1-7分别为单条线虫DNA提取液的1、2、4、8、16、32、64倍液。图 3 单条松材线虫DNA梯度浓度PCR扩增结果2.3 单条线虫DNA梯度浓度PCR扩增结果单条松材线虫线虫DNA提取液稀释2、4、8倍时可以扩增出较好的条带，稀释32倍时仍能扩增出条带（图3），说明方法1提取线虫DNA的浓度和纯度都较高，在极微量的情况下仍能扩增出理想的条带。这将给其他研究提供充足的PCR产物，更有利于得到准确的DNA序列。2.4 方法1提取多种线虫DNA PCR扩增结果方法1可适用于多种线虫DNA的提取，提取效果可达到100%，并且没有非特异性条带产生，结果准确可靠（图4）。3 讨论线虫的分子生物学研究需要制备用于PCR反应的核酸，早期研究多需要抽提大量线虫，提取方法多为SDS破壁结合氯仿去除蛋白及其他杂质14-15。虽然该方法提取DNA纯度高，但氯仿的毒性较高，操作步骤繁琐，样本线虫种类纯度也不能完全保证。随着线虫研究的发展，要保证线虫样本的纯度，特别是线虫种类鉴定的需要，许多学者对提取线虫DNA的方法进行了摸索和改进，于是单条线虫的快速提取方法被应用于线虫分子生物学研究。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MM为 DL2000 Marker，泳道1-6分别为：食菌伞滑刃线虫、拟松材线虫、小角伞滑刃线虫、豆伞滑刃线虫、弗氏伞滑刃线虫、拟小刺伞滑刃线虫，泳道7-12分别为6种滑刃属线虫，泳道13-15分别为：雄双滑刃线虫、鲁姆滑刃属线虫、外真滑刃属线虫图 4 经方法1提取的多种线虫DNA PCR扩增结果提取单条线虫提取DNA，主要包括两方面的问题分两步，第一是线虫虫体及虫体细胞破裂，核酸溶解到溶液中；另一方面需要降低虫体中酶类和蛋白对DNA纯度及产量的影响。很明显，SDS结合氯仿大量提取方法提取单条线虫需多步次转移溶液并不断舍弃部分溶液组分，不但增加了污染的可能，降低了产量，而且加入大量的离子也可能影响PCR扩增出来的产物，及进行RLFP等进一步的研究，不适合单条线虫的DNA提取。而部分学者采用的方法，比如微型搅拌器（micro-vibromixer）破碎法、研磨法、手工切断法、超声波匀浆法都可能因仪器工具进入溶液带来污染，也会给本来微量的样品带来损失，而手工切断线虫还需要一定的技巧。采用剧烈变化的温度处理线虫，可使虫体及细胞充分破裂，而且极端的温度也会使酶类钝化或变性失活，减少核酸降解。另外，本实验室相关研究表明，当没有液氮时用-70冷冻线虫至少15 min替代，同样可达到液氮处理1 min的效果。本文采取的快速提取方法主要有如下优点：(1)使用Taq酶附带的PCR Buffer代替WLB裂解液和SDS裂解液，减少了配置的不确定性和外来离子的影响。(2)整个提取过程在一个PCR管中完成，并可直接用于PCR扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添加，减少污染和对后续PCR的影响。（3）使用变温处理代替其他手工破碎方法，减少了外界污染物的掺入。参考文献1 张立海，廖金铃，冯志新. 松材线虫rDNA的测序和PCR-SSCP分析. 植物病理学报， 2001，31(1): 8489.2 蒋立琴. 伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究.杭州：浙江大学, 2006：29.3 葛建军，刁鹏，陈洪俊. 马铃薯金线虫的分子检测技术. 植物检疫，2008，22（1）：2123.4 Barstead R J, Kleiman L, Waterston R H. 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