细胞凝集试验实验讲义.doc

细胞凝集反应一、实验目的了解细胞膜的结构与功能。二、实验原理细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。凝集素(lectin)是一类含糖(少数例外)的并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。三、实验用品1、 土豆块茎2、 显微镜、粗天平、载玻片、滴管2支、离心管2支。3、 PBS缓冲液NaCl 7.2gNa2HPO4 1.48gKH2PO4 0.43gH2O 1000ml4、 2的红细胞四、实验步骤1、2的红细胞的制备：取一定量的红细胞，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2红细胞液。2、称取去皮土豆块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h，浸提液中含有可溶性淀粉土豆凝集素。3、用滴管吸取土豆凝集素和2红细胞液各一滴，置于载玻片上，充分混匀，静置20min后，于倒置显微镜下观察血球凝集现象。4、以PBS液加2血细胞液作对照实验。五、实验报告：简图表示血细胞凝集原理。细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。二、实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以水分进入细胞，引起溶血，溶质渗入速度不同，因此溶血时间也不同。三、实验材料和试剂1、 器材：50ml小烧杯，10ml移液管，试管，试管架。2、材料：动物血液3、试剂： 0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸钠 0.12mol/L草酸铵和0.12mol/L硫酸钠0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇和0.32mol/L丙酮四、实验方法1、动物血液的稀释：取1份血液，加入10份0.17mol/L氯化钠溶液即可。2、低渗溶液：取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释的血液，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。3、红细胞的渗透性：取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml稀释的血液，并轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？取试管一支，加入0.17mol/L氯化铵溶液10ml，再加入1ml稀释的血液，并轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？若发生溶血，记下时间(自加入稀释血液到溶液变成红色透明澄清所需时间)。分别在另外几种溶液中进行同样的实验。步骤同上。五、实验结果讨论与分析将观察倒的现象列入下表，对实验结果进行比较和分析。试管编号是否溶血时间结果分析1.10mlNaCl1ml稀释血液2. 10mlNHCl1ml稀释血液3. 10mlNHAc1ml稀释血液4. 10mlNaNO31ml稀释血液5. 10ml草酸铵1ml稀释血液6. 10mlNa2SO41ml稀释血液7. 10ml葡萄糖1ml稀释血液8. 10ml甘油1ml稀释血液9. 10ml乙醇1ml稀释血液10. 10ml丙酮1ml稀释血液果蝇的饲养与形态观察果蝇简介果蝇是在世界各地常见的昆虫，属于昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇属有3000多种，我国已经发现800多种，遗传学研究中通常用的是黑腹果蝇。作为遗传学研究的材料，果蝇具有非常突出的优点，它形体小，生长周期迅速，繁殖率高，饲养方便，世代周期短，约12天就可繁殖一代，突变性状多，染色体数目少，基因组小，实验处理十分方便，容易重复实验，便于观察和分析。果蝇的遗传学研究广泛而深入，尤其在基因分离、连锁、互换等方面十分突出，为遗传学的发展作出了突出的贡献。目前果蝇仍然是遗传学、细胞生物学、分子生物学、发育生物学等研究中常用的模式动物。实验目的 1.掌握果蝇的基本特征及鉴别雌雄果蝇的方法，熟悉常见突变型。2.了解果蝇生活周期特征及各阶段的形态变化。实验材料实验用品仪器设备：显微镜、指型管、毛笔。药品与试剂：乙醚、玉米粉、酵母粉、蔗糖、丙酸。实验内容和步骤 1.生活周期的观察 果蝇的生活史：果蝇与家蝇是不同的种，是完全变态昆虫，其完整的生活周期可分为4个明显的时期，即卵、幼虫、蛹和成虫。用放大镜从培养瓶外即可观察到这四个时期，也可取出用立体解剖镜仔细观察。果蝇的生活周期长短与温度关系很密切，低温使生活周期延长，生活力减低，高于30使果蝇不育甚至死亡。果蝇培养的最适温度为2025，25培养条件下果蝇从受精卵到成虫约10天，其中卵和幼虫期5天，蛹4天。成虫果蝇在25条件下约成活15天。 卵：受精卵白色，椭圆形，腹面稍扁平，长约0.5mm，在前端背面伸出一触丝，它能使卵附着在食物上。幼虫：受精卵经24h就可孵化成幼虫，幼虫经两次蜕皮到第三龄期体长可达45mm。肉眼观察可见幼虫一端稍尖为头部，上有一黑色的钩状口器。蛹：幼虫4天左右即开始化蛹。化蛹前三龄幼虫停止摄食，爬到相对干燥的表面，如培养瓶壁，渐次形成一个菱形的蛹。起初颜色淡黄、柔软，以后逐渐硬化变成深褐色，此时即将羽化。成虫：刚从蛹壳中羽化出来的果蝇，虫体较肥大，翅膀还未展开，体表也未完全几丁质化，所以呈半透明的乳白色。透过腹部体壁还可以观察到消化道和性腺。约1h后，蝇体即变为粗短椭圆形，双翅伸展，体色加深，如野生型果蝇初为浅灰，后变成灰褐色。成虫果蝇羽化后8h即可交配。雄果蝇的精子可贮存于雌果蝇的受精囊，以后逐渐释放道输卵管，雌蝇2天后即开始产卵，最初几天每天可产5070个，随后逐渐减少。2.果蝇的形态特征和常见突变的类型 果蝇的雌雄性别的鉴别 果蝇有雌雄之分，幼虫时很难区别，但成虫区别很容易。雄性的腹部环纹5节，末端钝而圆，颜色深。第一对脚的跗节前端表面有黑色鬃毛流苏，称性梳；雌性腹部环文7节，末端尖，颜色浅，跗节前端无黑色鬃毛性梳。雄性个体一般比雌性小。一些常见的突变性状果蝇的突变性状很多，已知的达几百种，并且随着研究的深入会发现或诱变产生更多的突变性状。果蝇的许多突变都是明显而且稳定的，大多是形态变异，容易观察。3.果蝇的麻醉的方法 对果蝇进行检查时，一般用乙醚进行麻醉，使其保持静止状态。由于果蝇对乙醚比较敏感，因此麻醉时应根据实验要求而定，作种蝇以轻度麻醉为宜，做观察时可深度麻醉，致死也可。麻醉程度是实验成功与否的关键步骤，麻醉不够，果蝇就会飞掉，麻醉过头又会杀死果蝇。果蝇翅膀外展45度角表示已经死亡。麻醉的操作步骤如下：1).轻摇或轻拍培养瓶使果蝇落到培养瓶底部。2).右手两指取下培养瓶塞，迅速将麻醉瓶口于培养瓶口对接严密。3).左手握紧两瓶接口处， 倒转使培养瓶在上。4).紧握两瓶接口，使两瓶稍微倾斜，右手轻拍培养瓶将果蝇震落到麻醉瓶中。注意不要将培养瓶中的培养基倒入麻醉瓶中，如培养基已变得太稀而易脱落，可采用麻醉瓶在上，而用黒纸或双手遮住培养瓶，使果蝇趋光自动飞入麻醉瓶中。5).当果蝇进入麻醉瓶后，迅速分开，将两瓶各自盖好。然后再将麻醉瓶的果蝇拍到瓶底，迅速拔开塞子，在塞子上滴几滴乙醚，重新塞上麻醉瓶。6).观察麻醉瓶中的果蝇，约半分钟后果蝇便不再爬动，转动瓶子，果蝇在瓶壁上站不稳，麻醉就算成功了，即可倒在白瓷板上进行观察。7).果蝇麻醉状态通常可维持510min，如果观察中苏醒过来，可进行补救麻醉，即用一平皿，内贴一带乙醚的滤纸条，罩住果蝇形成一临时麻醉小室。4.果蝇培养 将果蝇移入新培养瓶时，须将瓶横卧，并在培养基上薄博铺上一层玉米粉，然后接入510对果蝇，待果蝇清醒后，再把培养瓶竖起，以防果蝇粘在培养基上。果蝇培养基A：糖6.2g，加琼脂0.62g，再加水38ml。煮沸溶解。 B：玉米粉8.25g，加水38ml，加热搅拌均匀。A、B混和加热后成糊状后，加0.5ml丙酸，充分混匀后，再加0.7g酵母粉，搅拌均匀后，趁热分装至指型管中，每管约2cm厚。 注意事项分装时不要把培养基倒在瓶壁上。刚配制完的培养基放凉后在瓶壁上会有许多水滴，这时如果将果蝇放进去，水滴可能将果蝇的翅膀粘住，为避免发生此事，可将配好的果蝇培养基放置温箱内23d，待水分蒸发后再使用，或用酒精棉球将瓶壁上的水分擦掉。5.实验交配 果蝇雌体生殖器官有受精囊，可保留交配所得的大量精子，能使大量的卵受精，因此在做品系间杂交时，雌体必须选用处女蝇。雌果蝇一般出后几个小时内不会交配，所以把老果蝇除去后，几个小时内所收集到的雌蝇必定为处女蝇。由于雌蝇两天内不产卵，所以雄果蝇可以直接放到处女蝇培养瓶中。 果蝇唾腺染色体观察一、实验原理唾腺染色体是一类存在于双翅目昆虫，如果蝇、摇蚊幼虫唾液腺中的巨大染色体，双翅目昆虫的唾液腺细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而永久停留在分裂间期。但随着幼虫的生长，唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而且不分开，经过多次的复制形成约10004000拷贝的染色体丝，合起来直径达5um，长度达400um，比普通细胞中期染色体约达100150倍，所以称为多线染色体或者巨大染色体。唾腺染色体的另外一个特点是体细胞中同源染色体处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万核蛋白纤维丝结合在一起，紧密盘绕。所以细胞中染色体只呈单倍数。黑腹果蝇的染色体数目2n8，其中第II、第III染色体为中部着丝粒染色体，第4IV和第I（X染色体）染色体为端着丝粒染色体。唾腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一个染色体中心，所以在光学显微镜下可见染色中心伸出6条配对的染色体臂，其中5条为长臂，1条为紧靠染色体中心的很短的臂。 唾腺染色体经染色后，呈现颜色深浅不同、疏密各异的横纹。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有物种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系的。从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较，而一旦染色体上发生了缺失、重复、倒位、易位等结构变化，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。二、实验目的1.学习取出果蝇等幼虫唾腺的技术和制作唾腺染色体标本的方法。2.了解果蝇唾腺染色体的形态学及遗传学特征。 三、实验材料黑腹果蝇的三龄幼虫。这种材料既易饲养，又易取得唾腺，但为了得到更好的染色体标本，需要在2025和营养良好的条件下饲养幼虫。选择行动迟缓、肥大，爬上管壁的三龄幼虫(就要化蛹了)做标本最佳。 四、实验器具和药品用具：双筒解剖镜，显微镜，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，滤纸，绘图纸。药品：果蝇培养基，苯酚品红，生理盐水。配方：石碳酸品红(carbol fuchsin):母液A：3g碱性品红，溶解于100ml的70酒精中(此液可长期保存)。母液B：取母液A10ml，加入90ml的5石碳酸水溶液(两周内使用)。石碳酸品红染色液：取母液B45ml，加入6ml冰醋酸和6ml37甲醛。配方：改良石碳酸品红取石碳酸品红染色液210ml，加入9098ml45的醋酸和1.8g山梨醇。五、实验步骤 取一条三龄幼虫（往往已爬上培养瓶壁），置于载玻片上，并加一滴生理盐水，置双筒解剖镜下观察。首先熟悉幼虫具一钝尾和一带黑色口器的尖头端。 在解剖镜下用解剖针压住头部，压点尽可能靠头部口器处。 幼虫头部固定之后，再用另一针压住尾部（或用尖头镊子夹住），平稳快速一拉，使口器部分断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾液腺也随之而出。唾液腺是对透明的香蕉状腺体，仔细观察可发现由一个个较大的唾液腺细胞组成。分离的腺体可能伴有消化道和脂肪体。在载玻片上再加一滴生理盐水，用刀片或解剖针仔细剔除这些杂物，仅让腺体留下。用滤纸将多余生理盐水吸去，注意不要碰着腺体，以防吸走。然后滴上石炭酸品红，染色10min左右。 染色后，盖上盖玻片，用滤纸轻轻吸去多余染料，然后平放在实验桌上，用大拇指压下盖片，用力适当即可获得染色体分散良好的 制片。 显微镜下观察制好的压片。 酸性磷酸酶的显示酶是催化细胞内生物化学反应的特殊蛋白质。酶的正常与否反映了机体的功能。酶有高度特异性，它仅作用于一种或一类底物。因而，将酶催化其底物形成的最终产物显示出来，也就间接地显示了酶。酶细胞化学是利用酶催化反应形成的产物能在光镜或电镜下被识别的原理，来观察研究酶在组织细胞内的定位及其活性变化规律的科学。 酶细胞化学显示法一般有：金属沉淀法：酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基团与金属离子结合而沉淀，最后使酶的活性所在处形成不容性的有色沉淀。偶氮偶联法：酶使底物（萘酚化合物）分解，萘酚释放，后者与重氮盐（重氮盐是芳香族胺与亚硝酸的反应产物经重氮化作用过程所形成）结合形成不溶性的偶氮色素，其显示处即为酶的活性所在。吲哚酚法：酶活性促使吲哚酚释放吲哚基，后者很快被氧化为不溶性靛蓝产物。四唑盐法：产物被某些氧化物或脱氢酶氧化脱氢后，产生的氢离子传递给四唑盐，后者被还原形成有色沉淀物。 一、实验原理酸性磷酸酶是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内，正常条件下，巨噬细胞处于休止状态，酶活性很低。但在合适的pH条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现出一系列显著的变化，如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增强，从而改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。 通常酸性磷酸酶在一定的酸碱条件(pH5.0)下发生作用，能水解磷酸酯而释放磷酸基，PO43可使作为底物的硝酸铅发生反应，生成磷酸铅沉淀物，但磷酸铅是无色的，需再与黄色的硫化铵反应，生成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在和分布情况。甘油磷酸钠 甘油PO43 PO43Pb(NO3)2 Pb3(PO4)2Pb3(PO4)2(NH4)2S PbS(棕黑色)二、实验目的1.掌握酸性磷酸酶的定位的基本原理和方法。2.观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。 三、实验用品一）、实验材料：小白鼠二）、试剂1.6淀粉肉汤 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g NaCl 0.5g 可溶性淀粉 6.0g 蒸馏水 100ml 煮沸灭菌，4 保存，使用时热水浴融化。 2.10中性福尔马林（pH6.87.1） 甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g3.1硫化胺溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 99ml 此液应在临用前配制，有很大的刺激味道，在通分橱里进行操作。4.Giemsa染液 Giemsa原液 3滴 pH6.8磷酸缓冲液 5ml5.酸性磷酸酶作用液 蒸馏水 90ml 0.2mol/L醋酸钠(pH4.6) 12ml 5%硝酸铅 2ml 3.2甘油磷酸钠 4ml 先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混边搅匀，若pH值不到5.0，可加入少量醋酸调整，此液最好是临用前配制，不能贮存。 6.0.2mol/L醋酸钠(pH4.6)7.5硝酸铅8.pH6.8磷酸缓冲液三）、实验仪器注射器、解剖剪、镊子、恒温水浴锅、显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、吸水纸、擦镜纸、显微镜四、实验步骤与方法1.取小白鼠一只，每日腹腔注射6淀粉肉汤1ml，连续注射三天。2.在最后一次注射后34h，再向腹腔注射生理盐水1ml，35min后在原注射部位抽取腹腔液0.10.2ml或处死小鼠，取出腹腔液。3.将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每片12滴，用吸管涂开，迅速放到冰箱内，让细胞干燥。4.约30min后，将玻片转入10中性福尔马林，冰箱内固定30min。5.自来水漂洗5min，把水甩干。转入酸性磷酸酶作用液中，37处理30min。6.自来水漂洗片刻后，用1硫化铵处理35min。7.自来水冲洗，甩干。用1:30的姬姆萨染液染色510min。8.自来水冲去染液，用磷酸缓冲液临时封片，镜检。对照组：将涂片于50处理30min，或将涂片与没有甘油磷酸钠的酸性磷酸酶作用液中，其余步骤相同。显微镜下观察，小鼠腹腔巨噬细胞为不规则形状，阳性细胞内有大小不等的棕色或者棕黑色的颗粒即为酸性磷酸酶。注意事项作用液中铅离子的浓度是至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时，产生的磷酸离子不能被完全捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核内染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核内染色的现象。小鼠染色体标本的制备与观察一、实验目的1.学会小鼠骨髓染色体的制备2.了解常用实验动物的染色体数目及特点二、实验原理 染色体是有机体遗传信息的载体，对染色体的研究在生物进化、发育、遗传和变异中有十分重要的作用。处于分裂期的细胞经秋水仙素或秋水仙胺处理，由于阻断了纺锤丝微管的组装，使细胞分裂停止于中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态。三、实验用品1.仪器：光学显微镜，恒温水浴锅，冰箱，离心机，电子天平2.材料：小鼠（体重20g左右），解剖器械（搪瓷解剖盘，探针，剪刀，镊子），注射器（1ml），7号针头，脱脂棉，酒精灯，试管，磨口试剂瓶，滴管，染色缸，吸耳球，清洁载玻片（实验前将载玻片浸入50酒精溶液中，置4冰箱中至少1h）。3.实验试剂1).2柠檬酸钠溶液柠檬酸钠 2g蒸馏水 100ml2).500g/ml秋水仙素3). Giemsa原液 Giemsa染粉 1g 甘油 33ml 甲醇 45ml将染粉倒入研钵中，加几滴甘油，在研钵内研磨直到无颗粒为止，此时再将全部剩余甘油倒入，放入6065恒温箱中保温2h后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用。4).0.067mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)。 Na2HPO4.12H2O 11.81g KH2PO4 4.5g H2O 定容至1000ml5).1：10Giemsa磷酸缓冲液(pH6.8)。6).甲醇。7).冰醋酸。8).0.4%KCl溶液。四、实验步骤1. 动物按4g/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，34h后杀死动物。2. 取出动物后肢的胫骨和股骨，剪去两端。3. 将0.61ml2柠檬酸钠用1ml注射器注入骨髓腔，将骨髓冲出，取下针头，反复洗打骨髓细胞，使细胞团分散，转入10ml离心管中。4. 加入0.4KCl810ml，然后将离心管放置370.5水中低渗10min。5. 1000r/min离心8min。6. 弃上清，沿管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸(3:1)固定液5ml，加固定液时不要冲动细胞团。7. 加完固定液后，立即用吸管将细胞轻轻吹打均匀，静置固定20min，如此反复23次，每次20min。8. 固定的细胞离心后，吸去上层固定液，再加入少量的新配制的固定液，将细胞团吹打成悬液。9. 在干净、湿、冷的载玻片上滴1滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干或自然干燥。10. 将玻片标本平放于支架上 ，细胞面朝上，每片滴加1：10Giemsa磷酸盐缓冲液34ml，染色5min。11. 在自来水管下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸盐缓冲液，用吸水纸擦干玻片底面和四周，镜检。先用低背倍镜找出分散好的分裂相视野，再换高倍物镜观察，应该看到很多中期分裂相细胞，细胞被染成蓝色，细胞核及染色体被染成淡紫色。五、实验报告1. 画出你所看到的一个中期分裂相的图像。2. 小鼠染色体形态上有什么特点？共多少条？3. 微管特异性药物秋水仙素或秋水仙胺在本实验中的作用是什么？4. 总结制备成功或失败的经验。人血涂片的观察及ABO血型鉴定血涂片的显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法,应用极广。特别是对各种血液病的诊断有很大价值。但血片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，染色良好的血片是血液学检查主要基本技术之一。瑞氏染色法原理瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。美蓝(又名亚甲蓝mehylene blue)为四甲基硫堇染料,有对醌型和邻醌型两种结构,通常为氯盐,即氯化美蓝，美蓝容易氧化为一,二,三甲基硫堇等次级染料(即天青)市售美蓝中部份已被氧化为天青. 伊红(又名曙红cosin)通常为钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀, 即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后, 又重新解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。细胞的染色即有物理的吸附作用又有化学的亲和作用. 各种细胞和细胞的各种成份化学性质不同对各种染色料的亲和力也不一样. 因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各种不同的色彩, 例如血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白质与酸性染料伊红结合染粉红色称为酸性物质, 细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色称为嗜碱性物质, 中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色称中性物质.血液组成血细胞红细胞白细胞血小板血液血浆 (细胞间质)水血浆蛋白，糖，维生素，激素，代谢产物及无机盐等 1、血细胞 1）红细胞 ( erythrocyte, red blood cell, RBC ) 形态：胞体双凹圆盘状，中央较薄，周缘较厚；成熟红细胞无核，无细胞器，胞质内充满血红蛋白（hemoglobin) 特点：有一定的弹性和可塑性；细胞膜是一种半透膜；细胞膜具有特殊的 ABO 血型抗原正常值 RBC 男性 400万 500 万/l 女性 350万 450万/l Hb 男性 12 15 g/100ml 女性 10.513.5g/100ml临床上，若RBC 300万/l 和Hb 10 g/100ml，即为贫血。2）白细胞( leukocyte, white blood cell, WBC)白细胞有粒白细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞无粒白细胞淋巴细胞单核细胞 正常值:400010000/l中性粒细胞 ( neutrophilic granulocyte, N )形态：胞体球形 结构：胞核呈蓝紫色，染色质呈块状，着色深，成熟 N 胞核多为分叶状，一般可分25叶，常见3 叶，幼稚N 胞核呈杆状。胞质中含许多散在细小颗粒：嗜天青颗粒（溶酶体）、特殊（分泌）颗粒，Wright染色呈紫红色特点：占白细胞总数的5070%，是数量最多的白细胞功能：趋化作用和吞噬功能 嗜酸性粒细胞( eosinophilic granulocyte, E) 形态：球形 结构：光镜下核常分2叶；胞质内充满粗大均匀的嗜酸性颗粒，在Wright染色中呈桔红色电镜下颗粒多呈椭圆形，有膜包被，颗粒内含电子密度高的长方形结晶体，其周围是一层电子密度低的基质 功能：趋化性、吞噬能力较弱，但能选择性吞噬抗原抗体复合物，杀菌力低。在过敏性疾病和寄生虫感染时增多 嗜碱性粒细胞 ( basophilic granulocyte, B) 特点：数量最少，占白细胞总数的01% 形态：球形 结构：光镜下胞核分叶或呈S型，染色浅；胞质内含有嗜碱性颗粒，大小不等，分布不均，染成蓝紫色，可覆盖在核上光镜下颗粒内呈密度不一的细粒状，或呈致密的板层状。 功能：与肥大细胞功能相似，参与过敏反应 淋巴细胞( lymphocyte) 特点：占白细胞总数的2530% 形态：呈圆形或卵圆形，大小不等 结构：胞核呈圆形，一侧常有小凹陷，染色深；胞质较少，环绕核周围呈一窄带，嗜碱性，呈蔚蓝色。 功能：免疫防御功能 分类：T细胞、B细胞、杀伤细胞、 自然杀伤（NK）细胞 单核细胞(monocyte) 特点：占白细胞总数的38% 形态：胞体大，呈圆形或椭圆形；胞核形态多样，可呈卵圆形、肾形或马蹄形，核常偏位，染色质颗粒细而松散，故着色浅；胞质较多，呈弱嗜碱性常染成蓝色，内含许多细小的嗜天青颗粒。 功能：活跃的变形运动、趋化性、吞噬功能，可分化为巨噬细胞。3）血小板 ( blood platelet ) 形态：外形呈双凸扁盘状，大小不一，受刺激时可伸出突起，呈不规则形，血涂片上常呈星形或多角形。 结构：光镜下每一血小板周围部分染成浅蓝色，称透明区，中央部分有紫色颗粒，称颗粒区电镜下透明区有微管、微丝。 功能：止血和凝血 正常值：1040万/ l一、实验原理根据凝集原与凝集素之间的免疫反应关系，用已知的凝集素等（抗体）鉴定被检查者红细胞上的未知的凝集原（抗原）。若将血型不相容的两个人的血滴放在玻片上混合，其中的红细胞即聚集成簇，这种相容称为凝集 ( agglutination )。红细胞的凝集有时还伴有溶血。造成红细胞凝集的机制是抗原-抗体反应。凝集原的特异性完全取决于镶嵌入红细胞膜上的一些特异糖蛋白，在凝集反应中糖蛋白起着抗原的作用，因而称它们为凝集原。能与红细胞膜上的凝集原起反应的特异抗体则称为凝集素(agglutinin)。凝集素是由-球蛋白构成的，它们溶解在血浆中。发生抗原-抗体反应时，由于每个抗体上具有10个左右与抗原结合的部位，抗体在若干个带有相应抗原的红细胞之间形成桥梁，因而使它们聚集成簇。 二、实验材料、试剂 实验材料：医用采血针、酒精棉球、载玻片、消毒牙签 实验试剂：瑞氏染液、抗B血清、抗A血清、生理盐水、蒸馏水三、实验步骤ABO血型的鉴定1、 取一块清洁玻片，用记号笔标上(A、B)记号。2、在A侧加一滴抗A标准血清，在B侧加一滴抗B标准血清。3、以穿刺法自左手无名指指尖取血，在玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧 抗血清和血液混和。每边用一支牙签，切勿混用。4、静置室温下1015min后，观察有无凝集现象，并据此判断血型。 如果两侧均不凝集，则为O型；只有A侧发生凝集反应，则为A型；只有B侧发生凝集反应，则为B型； A,B两侧均凝集，则为AB型。 血涂片的制作及血细胞观察1. 取末捎血一滴置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后便推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动,载片上保留下一薄层血膜2. 血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动,使血膜迅速干燥,以免血细胞皱缩.3.用蜡笔在血膜两侧划线,以防染液溢出,然后将血膜平放在染色架上. 加瑞氏染液2-3滴,使覆盖整个血膜,固定0.5-1.0分钟. 滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水,与染料混匀染色5-10分钟.4.用清水冲去染液,待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。5.白细胞分类计数选择涂片的体尾交界处染色良好的区域,在油镜下计数100个红细胞, 按其形态特征进行分类计数,求出各类细胞所占比值(百分率)思考题1.如何区别血液的凝集和凝固？其机理有何差别？2.根据你的血型，判断你能接受何种血型并且能够给何种血型供血？3.O型血人又被称为“万能供血者”，试根据ABO血型分型做出你对这一说法的理解。4. 绘图描述所观察的的血细胞形状。注意事项1.玻片的清洗：新玻片常有游离碱质,因此应用清洗液或10%盐酸浸泡24 小时,然后再彻底清洗。 用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸20分钟,再用热水将肥皂和血膜洗去,用自来水反复冲洗,必要时再置95%乙醇中浸泡1小时,然后擦干或烤干备用。使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干燥,中性、无油腻。2.细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须化学清洁,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性, 否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。3.一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐, 两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。4.血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落, 因此血膜必需充分干燥.5.染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低, 细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件.6.染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.7.冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.8.染色过深可用甲醇或酒精适当脱色,最好不复染,必须复染时, 可将染液先稀释好再复染。染色时应注意保护血膜尾部细胞,不能划掉.因为体积较大细胞常在此处出现。染色结果:在正常情况下血膜外观为粉红色,在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩,细胞核染紫红色,染色质清楚, 粗细松紧可辨。染色结果偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱,则所有细胞染成灰蓝色,颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗,偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色。人体染色体组型分析与分带技术 微量全血培养1966年以前基本上用Moorhead等1960年建立的人体外周血白细胞培养技术，它的优点是方法比较完善。缺点是取血量较多，手续较麻烦。近三十年来国内外绝大多数均采用微量全血培养技术，不但取血量少，而且可略去一些操作过程，如离心、分离血浆等，计数时，既方便，也节省人力与物力，便于推广应用。实验目的在体外培养外周血淋巴细胞，制备人的染色体实验原理在活体情况下，进入外周血的小淋巴细胞不能进行增殖，存活一定时间后就死去，由新进入外周血的小淋巴细胞补充。但在人工离体培养条件下，培养基中的PHA（phytohemagglutinin,植物血细胞凝集素）有刺激小淋巴细胞转化并进行分裂的能力。此时如加入适量秋水仙素（或秋水酰胺），便可使许多分裂细胞停滞于中期。采用常规制片技术，即可得到大量含染色体的标本。实验用品材料 人静脉血 器材 超净工作台、恒温箱、离心机、显微镜、移液管（5ml）、链霉素瓶（或25ml组织培养方瓶）、血浆瓶（100ml）、注射器（1ml、2ml）、烧杯（100ml）、量筒（50ml）、剪刀、镊子、酒精灯、精密PH试纸试剂RPMI-1640液（或Eagles液），小牛血清、肝素、PHA、双抗（青、链霉素）、5%NaHCO3、2%碘酒、75%酒精、2ug/ml秋水仙素（或2ug/ml秋水酰胺）淋巴细胞培养基组成，包括人工合成培养液、血清、PHA、肝素、抗菌素等。人工合成培养液有很多种，一般常用的有TC-199、McCoy5A、Ham F-10、Ham F-12、RPMI-1640等，PHA（phytohemagglutinin,植物血细胞凝集素）是从豆子（四季豆、雪山大豆、鸡子豆等）经0.85%生理盐水浸渍后提取的一种糖蛋白。 实验方法培养基的制备将无菌室紫外线灯开放12小时，洗和刷手，穿上无菌衣，拖鞋进入无菌室，开启超净工作台，关闭超净工作台的紫外线灯。用75%酒精擦洗手和各种试剂瓶，然后将RPMI-1640培养液（或其他培养液）、血清、肝素、双抗、PHA等移入工作台上。取10ml培养瓶（链霉素瓶）1个，内装： RPMI-1640液 4 ml 小牛血清 1 ml 肝素（600IU/ ml） 0.03ml PHA(5mg/ml) 0.04ml 青、链霉素（青霉素10 000 IU/ ml、链霉素10 000 ug/ml） 0.05 ml（1 ml注射器、5#针头、5滴，相当于最终浓度为青霉素100 IU/ ml，链霉素100 ug/ml）混匀后吸一滴测PH，如偏酸，可加5%NaHCO3，、如偏碱，可加 1mol/L HCl，调整至PH6.87.0采血用肥皂和水洗净供血者之手，再用2%碘酒、75%酒精擦指尖，待酒精完全挥发干后，用无菌采血针或三棱针刺破指尖，用无菌吸管吸血0.30.4ml移入培养瓶，轻轻摇动，使血与培养液混匀即可培养。或用2ml注射器，7#针头，先吸取肝素少许湿润针筒，从肘静脉采血12ml，每个培养瓶接种全血0.3ml左右。亦可去产院取脐带血作培养。培养在370.5温养箱中培养6872小时，终止培养前610小时加秋水仙素（2ug/ml），（或秋水酰胺2ug/ml）用1ml注射器接5#针头加34滴，使最终浓度为0.050. 2 g/ml。 人淋巴细胞染色体标本的制作实验目的初步掌握染色体标本制作方法及其原理了解人染色体的形态与数目实验原理 被秋水仙素（或秋水酰胺）停滞于中期的大量分裂细胞，用低渗溶液处理（一般用KCL或其他低渗液）使样品中的红细胞膜破裂，并使分裂细胞和转化的淋巴细胞膨胀，结合离心技术，即可去掉红细胞碎片。再用固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）使已膨胀的分裂细胞和转化的淋巴细胞膜破裂，随着分裂细胞膜破裂，染色体被释放出来，并且将其形态固定下来（通过低渗和固定，同时也使细胞质和染色体上部分蛋白质丢失）。然后采用空气干燥法制片，即可得到满意的染色体标本。 实验用品材料 培养三天的人血器材恒温水浴（370.5）、相差显微镜，水平离心机，药物天平（称量100g），烧杯（100ml），尖底离心管（10ml），吸管，清洁载玻片（制片前放置于40%乙醇溶液中，冰箱4至少保存1小时），量筒（50ml），废液杯（500ml），磨口试剂瓶（100ml），酒精灯，橡皮头，试管架，定时钟试剂低渗液：0.4%KCL（potassium chloride AR）固定液：甲醇(methyl alcolnol AR),冰醋酸(冰乙酸acetic acid glacial AR)每次在使用前按3：1新鲜配制3.Giemsa 原液配制 Giemsa 染粉 1g 甘油（AR） 33ml 甲醇（AR） 45ml将染粉倾入研钵，加几滴甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止。此时将全部剩余甘油倒入，置（600.5）温箱中保温2小时，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用4.0.067mol/L磷酸盐缓冲液配制(pH6.8) Na2HPO4.12H2O 11.81g (或Na2HPO4.2H2O 5.92g) KH2PO4 4.50g用蒸馏水溶解至1 000ml 实验方法 经370.5培养72小时的外周血细胞，终止培养前610小时加秋水仙素（2g/ml），（或秋水酰胺2g/ml），最终浓度为0.010.02 g/ml。1.由温箱取出培养瓶，用吸管将贴在瓶壁上的细胞轻轻冲散，并用吸管移至尖底离心管内。2.以1500r/min离心8min。3.用吸管小心吸去上清液，连同细胞和上清液约留1 ml，随即用吸管将细胞团块轻轻冲散。4.加入8ml 0.4%KCl(或0.075mol/L)液，于370.5水浴低渗处理10min。同时配置固定液（甲醇3份，冰醋酸1份）。5.预固定：加1ml新配置的固定液于已低渗的细胞中，用吸管吹打均匀。立即以1 500r/min离心 8min，用吸管除净全部上清液及沉淀上层较透明部分（红细胞碎片）。6.加新配置的固定液56ml，固定 20min。7. 1000r/min 离心6min，如此反复固定23次。8.固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配置的固定液，将细胞团块轻轻打散成悬液。 9.在干净、湿、冷之载玻片上加23滴细胞悬液，在酒精灯上文火烘干（在比较干燥的地方可以不用）。10.在相差显微镜下观察有无分裂相，如果分裂相不多、分散不好,染色体短,就不要再继续试验。如果只是分散不好，可用固定液重固定一次，再滴片。11.在相差显微镜下选择分裂相多，染色体分散好的，用Giemsa染色。12.Giemsa 原液和磷酸盐缓冲液(pH6.8)1:10配置成Giemsa磷酸盐缓冲液染液，将玻片标本面朝上平放于玻璃支架上，每片滴加染液 34ml ，染色10min。13.自来水细流冲洗12s ，空气干燥。即可作显微摄影，进一步分析用。实验结果取一张人的淋巴细胞染色制片，用Giemsa染液染色。在低倍镜下可观察到中期分裂相。可见散在中期分裂相间的被去掉细胞膜和细胞质的转化大小不同的间期淋巴细胞核。作业先在低倍镜下观察中期分裂相的形态，再提高倍镜观察，计算一个中期分裂相的染色体数目。选择分散适度，染色体不重叠的中期分裂相，绘制染色体图，注明染色单体，着丝粒，长短臂，次缢痕和随体的位置，以及染色体的类型，并注明性别。在制作人的淋巴细胞染色体标本时应注意些什么问题？诱导物质的微核测试一、实验原理微核(micronuclei)简称(MCN)，也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。经过科研工作证实，整条的染色体或好几条也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂过程中行动滞后，在分裂末期不被两个子细胞核所排斥便形成了主核之外的小核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或是辐射累计效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其他高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药实验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传病和癌症前期诊断等各个方面。本实验介绍了小鼠骨髓细胞微核测试和蚕豆根类微核测试技术。二、实验目的1.了解微核测定的方法和毒理遗传学意义。2.学习小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核技术。3.为寻找新的测试系统或测定更多的环境因素。三、实验材料蚕豆根尖。成年小鼠四、实验器具和药品1.固定液：3乙醇：1冰醋酸2.染液：改良碱性品红液配方：石碳酸品红(carbol f