四环素族抗生素定向发酵.doc

吉林化工学院生物工程专业实验报告实验题目：四环素族抗生素定向发酵Tetracycline antibiotics directional fermentation课程类型： 生物工程专业实验 实验类型： 设计型专业班级： 学生姓名： 学生学号：合作者： 指导教师： 提交日期： 2015年11月23日吉 林 化 工 学 院Jilin Institute of Chemical Technology四环素族抗生素定向发酵实验 摘要：通过金色链丝菌在不同培养基中产生不同的产物，了解定向发酵的意义。另外通过实验更进一步学会根据抗生素生物合成的不同途径寻找各种抑制剂或促进剂，以调节某些酶的活性,从而改变代谢途径。四环素和金霉素都能在酸性条件下加热生成黄色脱水四环素和脱水金霉素其产生黄色的深浅与它们的含量多少成正比。所以通过反应比色即可知道二者地总含量（预先要做好四环素浓度的标准曲线），称其为总效价。关键词：金色链丝菌、定向发酵、四环素族抗生素、金霉素、总效价前言：定向发酵是指通过改变培养基的组分(如加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的某种产物。金色链丝菌能同时产生四环素和金霉素，这二种抗生素在分子结构上只是在第七位上差一个氯离子。四环素族抗生素族抗生素包括金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：当R1为Cl,R2为H时分子为金霉素；当R1和R2都为H时为四环素；当R1为H，R2为OH时为土霉素（羟基四环素）。金霉素比四环素只多一个氯离子，只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。从生物合成途径上可知四环素和金霉素有一段相同的生物合成途径，到某一个中间产物时，氯化酶活力的大小可能决定其合成途径的改变，所以我们设计从控制氯化酶的活性和氯化酶的量来影响菌种的代谢途径，从而得到不同的产物。本实验是通过在改变培养基的组分，来实现定向发酵。我们从下面两个方面考虑:（1）抑制氯化酶的活力利用硫醇基苯骈噻唑（M-促进剂）与氯化酶的激活剂二价铜离子作用，降低铜离子的浓度，从而使氯化酶的活力下降。（2）利用竞争性抑制剂来减少氯化酶的量加入一种基质，其能与某一反应的酶作用，使此反应的酶量减少，从而使此反应受到抑制的现象一般称竞争抑制。本实验利用溴离子在生物合成中对氯离子有竞争性抑制作用的原理。据研究四环素与金霉素有一共同的代谢分叉的间体，此中间体进一步的代谢方向取决于不同酶活力的大小，其示意图见（图31）图31四环素和金霉素分叉代谢示意图图31中A为四环素和金霉素的代谢分叉中间体，在此之前，四环素和金霉素的代谢途径相同，A物质在E1酶的作用下生成B物质，它进一步代谢即生成四环素（TC）。A物质在有氯离子存在时，在氯化酶E2的作用下生成ACl，然后再在E1酶的作用下生成BCl，再进一步反应即生成金霉素(CTC)。因此，A物质究竟向那个方向代谢，则取决于系统中氯离子与氯化酶存在的多少，所以若把氯化酶的量减少，反应就会较多的向四环素方向进行。现考虑加入溴化物作为竞争性抑制剂，因为氯化酶E2也可以催化溴化物的形成，从而消耗掉一些氯化酶减少金霉素的形成，在反应中也形成了一些溴四环素，但此反应速度较慢，整个反应还是形成较多四环素。此反应中随溴离子量的增加四环素量也有所增加，但随氯离子的增加四环素的量会减少。上述两个作用都有一定的局限性，第一个措施受硫醇苯骈噻唑毒性的影响，第二个措施受溴四环素的量和氯离子的限制，所以在生成四环素的过程中若用金色链丝菌用作生成菌、在水中又存在氯离子时，常将两个措施一起用，以最大限度地减少金霉素地量。2、化学法测定四环素和金霉素地原理如下：实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。四环素和金霉素都能在酸性条件下加热生成黄色脱水四环素和脱水金霉素其产生黄色的深浅与它们的含量多少成正比。所以通过反应比色即可知道二者地总含量（预先要做好四环素浓度的标准曲线），称其为总效价。在碱性条件下，金霉素不稳定，可生成无色的异金霉素，而四环素则比较稳定，然后将其在酸性条件下产生的黄色，比色测出的即为四环素的量。将测出的总效价值减去四环素的效价值即为金霉素的效价。 金霉素 异金霉素发酵液中，由于杂质的干扰将影响比色的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)可以减少杂质对比色反应的干扰。本实验用一支金色链丝菌在加入氯离子、硫醇基苯骈噻唑和溴化钠等物质的作用下看四环素和金霉素的产生量的多少，来验证上述原理和措施。通过培养基的配制和接种、发酵最后通过化学手段测定四环素和金霉素的效价，本实验因为培养时间较长学生实验可分二次进行。1实验内容：配制种子培养基和四种发酵培养基、接种子、转发酵。放瓶；测效价；利用比色法测定四环素和金霉素的效价。2实验材料和仪器：1、金色链丝菌菌种（由实验室提供）。旋转式摇床：转速230转/分。2、培养基原材料；（1）种子培养基配方：花生饼粉 2 (20g/L)；淀粉4 (40g/L)；酵母粉0.5 ；蛋白胨0.5 ；硫酸胺0.3 ；硫酸镁0.025 %；磷酸二氢钾0.025 %；碳酸钙0.4 %；PH自然。（2）发酵培养基配方：花生饼粉4 (40g/L)；淀粉10 ；酵母粉0.2 ；蛋白胨1.4；硫酸胺0.25 ；硫酸镁0.25 %；淀粉酶0.02 %；碳酸钙0.5 %；pH自然。EDTA 试剂，取乙二胺四乙酸二钠盐 4.5 克，和NaOH 5.5克溶解于5000ml 蒸馏水中。固体草酸、乙二胺四醋酸二钠盐（EDTA）混合试剂、4 N盐酸、721分光光度计3实验步骤：（1）配种子培养基，配制时淀粉要先糊化。配置100ml , 取30 ml，250ml 三角瓶中八层纱布，外加牛皮纸。（2）接种：种子培养基消毒后冷却，在无菌室中将金色链丝菌斜面挖一小块放入培养基中然后放在旋转式摇床上28培养20小时。（3）配发酵培养基：先将所需淀粉糊化后冷却至60左右，加入淀粉酶。在60水浴中保温1020分钟待淀粉液化后在把其它成分放入。（4）将配好的发酵培养基分成四分分别编号：配置200ml , 分别取4次，每次40 ml，放置250ml 三角瓶中八层纱布，外加牛皮纸。1对照（即为上述培养基）2加入0.3溴化钠3加入0.3%氯化钾4加入0.3%溴化钠和0.0015%M-促进剂（M促进剂的原始浓度为0.05%）（5）接发酵:种子长好后（不染菌、种子液较粘稠、菌丝粗壮）接入发酵培养基，接种量为10 。再放入摇床转速220-230r/min，28 培养5天。4标准曲线绘制标准溶液配制，精确称取四环素标准品，若干毫克溶于50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，配制成四环素标准溶液，使溶液浓度为1000 U/ml 左右标准曲线绘制， 分别吸取上述标准溶液，1.0 ml, 0.8 ml.0.6 ml,0.4 ml,0.2 ml于50ml容量瓶中， 加EDTA 混合试剂11 ml ,放置5 min 后，再加2.0 mol/L HCL 4 ml 与此同时，另外做5只空白样品，操作方法相同，然后将空白样品直接用蒸馏水稀释至刻度，而样品放在沸水中加热5 min ,冷却后，测定的吸光度A440为纵坐标，作标准曲线。1、放瓶：摇瓶从摇床上拿下来后应进行下列参数的测试与观察：pH、 颜色、粘度、气味及虑速等实验数据。2、 固体草酸调pH至1.5-2.0，调试过程中要充分摇匀，避免过酸。3、 滤得滤液。4、 四环素效价得测定：取滤液0.3-0.5ml（视效价高低而定）放入50ml容量瓶中加入EDTA混合试剂（含NaOH）11ml放置5分钟加2mol/L盐酸4ml煮沸5分钟迅速冷却后，用蒸馏水稀释至刻度用分光光度计上440nm波长下比色，测得光密度值A440后查标准曲线即可得四环素的效价。四个样品均按上法测试，每个样品均需单独做对照对照做法同上只是取消加热直接稀释，比色时一一对应。终止发酵过程记录终止发酵时间，摇床转速，摇床温度。记录发酵液的粘度（挂瓶程度）；颜色；气味；;pH 值；镜检菌丝体（留照片）。固体草酸调pH至1.5-2.0，调试过程中要充分摇匀，避免过酸。用250ml塑料离心杯，每杯装入两个平行发酵瓶中的发酵液。用5000转/分离心-5分钟，取其上清液。四环素效价测定四环素的吸光度= 总吸光度- 对照（底色）吸光度。对照（底色）吸光度分析样品制备法使用移液管取离心上清液2ml放入50 ml容量瓶中加入EDTA混合试剂（含NaOH）11ml摇匀后放置5分钟加2mol/L盐酸4ml，摇匀，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用酶标仪测定底色吸光度。总吸光度分析样品的制备法使用移液管取离心上清液2ml放入50 ml容量瓶中加入EDTA混合试剂（含NaOH）11ml摇匀后放置5分钟加2mol/L盐酸4ml，摇匀（别激动现在不定容）煮沸5分钟迅速冷却后，再用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，。酶标仪测定总吸光度。四个样品均按上法测试，每个样品均需单独做对照，对照样做法同上只是取消加热直接稀释。比色时其位置要一一对应，以便于计算。总效价的测定总效价吸光度 = 总吸光度- 对照（底色）吸光度。总效价总吸光度分析样品的制备法：取发酵液离心上清液2ml加入50ml容量瓶中加入蒸馏水11ml，摇匀。加入2mol/L盐酸4ml，摇匀。 煮沸5分钟迅速冷却后稀释至50ml，摇匀。酶标仪测总效价。方法同上只是不加热直接稀释。（2）总效价对照（底色）吸光度分析样品制备法：取发酵液离心上清液2ml加入50ml容量瓶中加入蒸馏水11ml，摇匀。加入2mol/L盐酸4ml，摇匀。 直接用蒸馏水稀释至50ml，摇匀。酶标仪测总效价。5总效价的测定取滤液0.3-0.5ml加入50ml容量瓶中加入蒸馏水11ml加入2mol/L盐酸4ml煮沸5分钟迅速冷却后稀释至50ml用440nm波长下比色，所得光密度查标准曲线即得各样品的总效价，各样品也要做对照。方法同上只是不加热直接稀释。6结果发酵时间=5天 摇床转速=210r/min 摇床温度=28数据 第一组第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）发酵液粘度适中适中适中较粘稠有明显挂壁现象颜色黄色黄色黄褐色褐色气味无明显刺激性气味无明显刺激性气味稍微有点酸气无明显刺激性气味效价数据记录总效价吸光度 = 总吸光度- 对照（底色）吸光度。四环素的吸光度= 总吸光度- 对照（底色）吸光度。数据 OD第一组第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）四环素效价（对照）0.1260.0740.0820.117四环素效价0.1760.1320.1170.217总效价(对照）0.1760.0760.1280.083总效价0.2350.1430.2080.204结果计算组别OD第一组第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）四环素效价0.0500.0580.0350.1总效价0.0590.0670.080.121分别将四环素效价和总效价的OD值带入四环素效价标准曲线y=3.8756x里面可得OD效价第一组第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）四环素效价0.193780.2248370.13567750.38765总效价0.228710.259730.310120.4691数据效价第一组第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）金霉素效价0.034930.0348930.174440.08145四环素是两性化合物，等电点是5.4，而蛋白质的等电点也在5.3左右。如果将PH调至5.4，蛋白质也会沉降，起不到分离目的。而四环素类抗生素在4.0-7.0（这两个数字不是很准确，待确定）之内均能沉淀，故调至4.5-4.6。另外四环素类抗生素在PH5.0时，不是很稳定，所以调PH时用比较弱的碱氨水。实验中，因为操作原因导致实验有误差，其中三号试验品略微有染菌的迹象发生。但总体来说还在可控的实验误差范围之内根据图表结果可以看出加入0.3%溴化钠和0.0015%M-促进剂的实验组在四环素方面有明显的提升，有助于菌种对四环素的分泌和生产，而其他两组并没有明显的提升。试验后我们经网上查询发现金色链霉菌经溶菌酶处理形成的原生质体细胞，可增大对紫外线的敏感性。选育出的菌株H32-37是一株形态上变异较大的高产菌株，四环素生产效价可稳定在26000r/ml，较出发菌株提高了44.4%。其发酵性能较好且遗传性稳定，具有一定的生产应用前景。据结果表格可知加入0.3溴化钠和0.3%氯化钾和0.3%溴化钠和0.0015%M-促进剂均对四环素的效价有明显提升，其中加入0.3%溴化钠和0.0015%M-促进剂的提升最高。另外加入0.3%氯化钾对于金霉素的效价提升最高鸣谢我历时将近一周时间终于把这篇论文写完了，在这段充满奋斗的历程中，带给我的学生生涯无限的激情和收获。在论文的写作过程中遇到了无数的困难和障碍，都在同学和老师的帮助下度过了。在此，我向指导和帮助过我的老师们表示最衷心的感谢！同时，我也要感谢本论文所引用的各位学者的专著，如果没有这些学者的研究成果的启发和帮助，将无法完成本篇论文的最终写作。至此，我也要感谢我的朋友和同学，他们在我写论文的过程中给予我了很多有用的素材，也在论文的排版和撰写过程中提供热情的帮助！金无足赤，人无完人。由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和同学批评和指正！参考文献1，丁焕新. 四环素在非感染疾病中的临床应用. 新医学，1989；20(3)：1522，刘加升. 四环素在外科疾病中的硬化治疗近况. 新药与临床，1991；10(5)：2853，Ford L M, Eaton T E, Godfrey O W. 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