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免疫组织化学技术 1 免疫组织化学 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学 它是组织化学的分支 它是用标记的特异性抗体 或抗原 对组织内抗原 或抗体 的分布进行组织和细胞原位检测的技术 2 基本原理抗原抗体反应 即抗原与抗体特异性结合的原理 通过化学反应使标记抗体的显色剂 荧光素 酶 金属离子 同位素 显色来确定组织细胞内抗原 多肽和蛋白质 对其进行定位 定性及定量的研究 3 免疫组化的特点特异性强敏感性高定位准确 形态与功能相结合 4 免疫组化的作用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质 如肽类 激素 神经递质 细胞因子 受体 表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示 5 实验所用标本 石蜡切片是制作组织标本最常用 最基本的方法 对于组织形态保存好 且能作连续切片 有利于各种染色对照观察 还能长期存档 供回顾性研究 6 实验设备 恒温冰冻切片机 脱水机 石蜡包埋机 切片机 摊片机 烤片机 冰箱 电磁炉 高压锅 染色架以及离心机和免疫组化试剂等 7 8 9 脱水机 石蜡包埋机 10 免疫组化技术分类 1 免疫荧光方法2 免疫酶标方法3 免疫胶体金技术4 免疫铁蛋白法5 放射免疫自显影法 11 酶联免疫组织化学 ABC法S P法 12 免疫组化操作步骤 13 一 石蜡切片制作 1 固定 取组织 用PBS冲洗 放入4 多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h2 脱水 倒去固定液 用蒸馏水冲洗3次 再用50 酒精冲洗2次 用酒精逐级脱水 70 酒精1天 80 酒精过夜 95 酒精3h 无水酒精 各2h3 透明 1 1无水酒精二甲苯45min 二甲苯 各30min4 包埋 恒温箱内进行 浸入石蜡 1 1二甲苯石蜡 58 45min 石蜡 共2 5h 用石蜡 包埋组织 14 5 切片 包埋后的组织块经修整后 用切片机切成5 7 m 的石蜡带6 贴片 将组织石蜡块在50 温水中展片 然后用处理干净的载玻片捞片 组织带可黏在载玻片上 洗片 1 HCl浸泡过夜 蒸馏水冲洗 95 酒精浸泡2h后擦干 涂胶 防脱剂多聚赖氨酸 7 烤片 68 恒温箱内烤片2h 15 二 SP 链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连结 三步法染色步骤 1 脱蜡 水化60 20分钟 二甲苯2 10分钟100 的绝对乙醇 2 5分钟 95 ethanol2minutes 95 的乙醇2分钟80 ethanol2minutes 70 ethanol2minutes distilledwater 5min 蒸馏水 5分钟PBS洗3次 3min 16 2 阻断 3 H2O2去离子水 或80 甲醇 孵育10min 以灭活内源性过氧化物酶活性3 PBS冲洗2 3次 每次5min4 抗原修复 置0 01M枸橼酸缓冲液 PH6 0 中用煮沸 95 15 20min 自然冷却20min以上 再用冷水冲洗缸子 加快冷却至室温5 PBS冲洗2 3次 每次5min6 封闭 滴加正常山羊血清封闭液 室温孵育20min 甩去多余液体7 滴加 抗50 l 室温静置1h 或者37 1h 或者4 过夜 需在37 复温45min 8 PBS冲洗2 3次 每次5min 17 9 滴加辣根过氧化物酶标记的 抗40 50 l 室温静置1h 或37 1h10 PBS冲洗2 3次 每次5min11 滴加SP 链霉亲和素 过氧化物酶 室温或37 孵育30min 1h12 PBS冲洗2 3次 每次5min13 显色 DAB显色5 10min 在显微镜下掌握染色程度 胞浆呈棕色者判定为阳性细胞 显色剂的配置 在1ml水中加1滴显色剂A 摇匀 然后加1滴显色剂B 摇匀 再加1滴显色剂C 摇匀 A DABB H2O2C 磷酸缓冲液 18 14 自来水冲洗10分钟终止反应15 复染 苏木精复染2min 盐酸酒精分化16 自来水冲洗10 15min17 常规脱水50 ethanol1 2min 70 ethanol1 2min95 ethanol1 2min 95 ethanol1 2min 100 absoluteethanol 1 2 min 透明 Xylene1 1 2 min Xylene2 1 2 min封片 用中性树胶滴在组织旁边 再用盖玻片盖上 镜检 19 三 二步法免疫组化染色步骤 二甲苯脱蜡 梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次 每次3分钟根据每一种抗体的要求 对组织抗原进行相应的修复0 3 过氧化氢甲醇液阻断20分钟 以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗 浸泡5分钟 3次正常山羊血清室温封闭10分钟 20 甩去血清 加入适当稀释的一抗 37 孵育60分钟或4 过夜PBS冲洗 浸泡5分钟 3次滴加多聚螯合物 37 孵育30分钟PBS冲洗 浸泡5分钟 3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色3 10分钟流水冲洗苏木素复染 脱水 透明 封片 显微镜观察拍照IPP软件分析光密度 21 几种抗原修复方法 真空负压抗原修复法 切片脱蜡至水 0 3 H2O2甲醇真空负压处理5分钟 自来水洗 蒸馏水洗 0 01M柠檬酸盐缓冲液 PH6 0 真空负压干燥箱预先调至95 真空负压处理10分钟 待修复注降至室温的一 PBS洗3次 随后按选好的免疫组化染色方法进行染色 22 微波辐射抗原修复法 切片脱蜡至水 0 3 H2O2甲醇处理10分钟 自来水洗 蒸馏水洗 0 01M柠檬酸盐缓冲液 PH6 0 于微波炉内微波辐射10分钟 如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右 待修复液降至室温后 PBS洗3次 随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色 23 高压抗原修复法 切片脱蜡至水 0 3 H2O2甲醇处理切片10分钟 自来水洗 蒸馏水洗 切片放入抗原修复液中 边同容器放入高压锅中加热至沸腾 盖上压力阀至喷汽后持续1 4分钟 待修复液恢复至室温后 PBS洗3次 随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色 24 电炉加热抗原修复法 切片脱蜡至水 0 3 H2O2甲醇处理切片10分钟 自来水洗 蒸馏水洗 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热 不时用温度计测量温度 当达92 后 即可拔离电源 当温度低于92 时 再插上电源 如此反复持续至10分钟左右 待抗原修复液降至室温后 PBS洗3次 随后按选定的免疫组化染色方法进行染色 25 胰蛋白酶消化法 切片脱蜡至水 0 3 H2O2甲醇处理切片10分钟 自来水洗 蒸馏水洗 PBS洗3次 1分钟 次 滴上自配的或商品化的胰蛋白酶 处理切片20分钟左右 PBS洗3次 2分钟 次 后按选好的免疫组化染色方法进行染色 26 所用试剂 1 PBS 0 01M磷酸盐缓冲液 pH7 4 配制 取NaCl8g KCl0 2g Na2HPO4 12H2O3 63g或Na2HPO41 44g KH2PO40 24g 溶于900ml双蒸水中 用盐酸调pH值至7 4 加水定容至1L 常温保存备用2 包埋剂 石蜡3 防脱剂 多聚赖氨酸 PLL5g 蒸馏水1000ml APES 3 氨丙基 3 乙氧基甲硅烷 27 4 固定液 4 多聚甲醛磷酸盐缓冲液 pH7 4 配制 a 0 1M磷酸盐缓冲液 取A液400ml与B液80ml混合后 调pH于7 4 再定容至500mlA液 0 1mol LNa2HPO4 Na2HPO4 12H2O35 8g加水定容至1000ml B液 0 1mol LNaH2PO4 NaH2PO4 2H2O15 6g加水定容至1000ml b 4 多聚甲醛磷酸盐缓冲液 取20g多聚甲醛溶于500ml0 1M磷酸盐缓冲液中 加热并搅拌约2 3h后溶解5 细胞通透液 由终浓度分别为0 3 双氧水和0 3 TritonX 100 曲拉通X 100又称清洁剂 混合而成 配制方法是先用微波加热的36mlPBS 再接着加120ulTritonX 100 并加热一会儿 冷却至临用前加0 4ml30 H2O2 28 6 抗原修复液 0 01M枸橼酸缓冲液 PH6 0 或0 01M柠檬酸盐缓冲液 pH6 0 配制 取A液8ml与B液42ml混合后加水至400ml 调pH于6 0 再定容至500mlA液 0 1mol L柠檬酸 C6H8O7 H2O21 01g加水定容至1000ml B液 0 1mol L柠檬酸钠 Na3C6H5O7 2H2O29 41g加水定容至1000ml 7 5 羊血清或封闭血清 用PBS稀释 含0 03 H2O2的0 05 DAB二氨基联苯胺 避光 用20 DAB 1 10mg ml 5ul 0 1ul30 H2O2 95ulPBS 8 一抗 特异结合底物1 100 二抗均用PBS稀释 9 二甲苯 梯度酒精 100 2 95 80 70 50 双蒸水 中性树胶 封裱剂 10 显色剂 DAB试剂盒 苏木素染液 29 免疫组化结果的判断原则 1 每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础 才能对染色结果做判断 2 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性 3 阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性结果无判断意义 阳性结果有强弱 多少之分 哪怕一个细胞阳性 只要是在抗原所表达部位 也有诊断意义 4 当免疫组化结果与HE切片诊断有矛盾时 以HE切片诊断为准 5 应用 反正法 确保免疫组化在诊断中的准确性 6 避免假阴性和假阳性的发生 30 免疫组化的应用范围 在常规病理诊断中应用免疫组化主要有8个方面 1 对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断 2 对肿瘤的良恶性进行综合判断 3 发现微小转移灶 4 激素受体的检测以指导临床治疗 5 激素类细胞的定性和定位 以明确内分泌细胞的类型和功能状态 6 指导肿瘤预后 如PgP CerbB 2 P53等 7 指导肿瘤分期 8 免疫性疾病的辅助诊断 如肾小球肾炎 某些皮肤疾病等组织内免疫复合物的检测 31 免疫组化染色中的常见问题及对策 免疫组化操作方法比较简单 然而在实际工作中也会遇到一些麻烦 如脱片 无特异性表达或表达较弱 染色过强 背景染色强 定位不好等 引起上述问题的原因较多 主要有组织固定 脱水不良或浸蜡温度过高导致抗原丢失 抗原未修复 抗体或工作液失效 抗体稀释不当 在一定温度下抗原孵育时间不足 一抗和二抗不匹配 显色剂失效或配置方法失误等 因此 良好的组织固定和脱水及适当的浸蜡温度是做好免疫组化的前提 中性福尔马林固定有利于正确结果的显示 32 1 脱片的可能原因与对策 整批切片脱片可能是载玻片未处理 玻片上有油污未清洗或未涂抹防脱片胶 或烤片时间不足致粘片不牢固 单张切片及整块组织脱片除了上述原因外 需考虑抗体热修复时液体温度过高和时间过长 或冲洗时用力过猛等因素 33 2 无特异性表达的原因 问题确认染色过程次序是否正确 是否忽略了某一过程 是否孵育了足够的时间 是否使用了正确的抗体 以及二抗是否和一抗一致匹配 底物显色系统是否失效 解决方法重新实验 设立阳性对照 以验证实验结果 仔细确定一抗与二抗种属 更换显色剂 DAB或AEC 不得使用过期试剂盒 不同批号试剂盒不能混用 34 3 表达较弱 问题标本固定方式不当或固定时温度过高 使部分组织抗原被破坏 抗原修复方式不当 抗体浓度过低 或者孵育的温度 时间不够 冲洗后切片残留多余缓冲液 如果阴性对照没有反应 阳性对照反应良好 而标本弱阳性 应考虑查标本本身原因 解决方法新鲜组织及时固定 防止自溶 固定时间不超过24小时 封闭时间不超过10分钟 或参考产品说明 注意复染时间提高抗体浓度 孵育时间不少于60分钟 室温低于15 改在37 温箱孵育或4 冰箱过夜 35 4 染色过强 问题抗体浓度过高或孵育时间过长孵育温度过高 37 显色速度过快或显色时间过长 解决方法降低抗体浓度 孵育时间 室温1小时或4 过夜 缩短显色时间 显色时间不超过5 10分钟 以显微镜下观察为准 36 5 非特异性背景染色 问题操作过程中冲洗不充分 加试剂后切片干燥 组织切片折叠 组织中含过氧化物酶未阻断 组织中含内源性生物素 组织抗原弥散 切片粘附剂过厚 血清蛋白封闭不充分 解决方法每步冲洗3 5 防止切片干燥 必要时重做 勿以折叠处观察染色结果 可配置新鲜3 双氧水封闭 孵育时间延长 正常非免疫动物血清再封闭 组织及时固定 固定液要合标准重新配置粘附剂涂液 延长血清封闭时间 37 6 染色定位不好 除涉及抗体因素外 应注意标本本身的前期处理及具体的操作方法等 38 7 封片时的注意事项 封片时动作快 切片入二甲苯后起白雾 为脱水未尽 记住切片的组织面 防脱片处理 盖片必须大于组织块 封固剂不要滴得太多 也不要太少 防止气泡产生 39 注意事项 一 抗体的保存浓缩抗体 有效期内 只需放在4 冰箱内 保存时间可达1 3年 即用型抗体 理论上在4 冰箱内可保存半年左右 PBS或抗体稀释液稀释的抗体 一般只可放置1 2个月 40 二 出现假阳性的原因组织切片质量不佳 造成假象 如刀痕裂缝边缘的组织着色过深 不能作为判断阳性的