基因工程复习知识点-内蒙古农业大学.doc

基因工程知识点总结 代课老师尹俊 10级生计2左俊整理基因工程复习参考知识点总结代课教师：尹俊整理：左俊说明：内容来源：网络，笔记，教材和个人理解。个人整理错误或者理解有误的地方，请自行改正，本人整理内容仅供参考。时间有限，整理仓促，资料有限，导致内容详略不一，请参考老师给的重点，添加缺少的内容，较详细啰嗦的内容可选择性参考。内容前后安排大致和老师所讲的顺序以及教材保持顺序一致。绪论（内容略）基因工程基本技术分子杂交分子杂交（hybridization) :有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交进行检测。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交进行检测。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。Western 印迹法：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:14(1)DNA提取(2)酶切DNA(3)凝胶电泳分离各酶切片段(4)使DNA原位变性(5)转膜(6)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点(7)探针与DNA杂交(8)通过放射自显影检查目的DNANorthern 杂交步骤：(1)取表达目的基因的组织样品(2)总RNA提取(3)分离mRNA(4)RNA电泳(5)转膜(6)预杂交(7)探针杂交(8)放射自显影原位杂交原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA，再将DNA烘干固定于膜上，与标记的探针杂交，检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。PCR PCR原理：变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。影响PCR扩增的影响因素：(1)聚合酶（TaqDNA聚合酶，易在3末端加A；Pfu聚合酶，高保真性，合成长片段和平末端）(2)dNTPs的浓度；(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。(4)引物浓度：0.1-0.5mol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；(5)Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L，影响酶的活性、引物-模板退火、特异性；(6)PCR反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数引物设计原则：（1）引物长度以18-25 bp为宜。（2）碱基尽可能随机分布,G+C占20-80%。（3）引物内部避免形成二级结构。（4）两引物间避免有互补序列。（5）引物3端为关键碱基，必须完全互补；5端无严格限制，可加入酶切位点。（6）上下游引物退火温度相差5以内。（7）内部避免重复序列。PCR特点：特异性强敏感性高快速简便可扩增RNA或cDNA对起始材料质量要求低单核苷酸错误掺入PCR分类1)不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板. 制备杂交探针. 基因组DNA结构功能的研究2)反向PCR (reverse PCR)：用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。3）定量PCR定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。目前主要有两种方法：荧光探针技术和双链DNA特异结合染料。PCR的应用：基因组克隆；基因合成；遗传病的诊断和研究；性别鉴定等。TA克隆：利用PCR反应中所使用的聚合酶具有在3加上A的末端转移的活性，使PCR产物与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法DNA测序方法Sanger双脱氧链终止法原理： 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。基因工程工具酶DNA聚合酶（1）大肠杆菌DNA聚合酶I基本性质：53的DNA聚合酶活性;53的核酸外切酶活性；35的核酸外切酶活性。基本用途：缺口前移：Nick translation （切口平移）；制备P标记的探针。（2）Klenow fragmentKlenow fragment的性质：具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。基本用途v末端补齐（补平5突出末端，切除3突出末端）vDNA 3末端标记（在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP）v在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成。v双脱氧末端终止法测定DNA序列（3） T4 DNA聚合酶基本特性：a.具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。b.在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切c.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止d.在有四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。基本用途a.补平隐蔽末端； b.DNA 3末端标记（4） T7 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶的特点：u持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。u35外切酶活性高：单链和双链都能降解。u不受DNA二级结构的影响T7 DNA聚合酶的用途以大分子量DNA为模板的合成：如M13进行末端标记：与T4 DNA聚合酶相同补平隐蔽末端：合成补平3隐蔽末端； 水解修平3突出末端。（5） 修饰后的T7 DNA聚合酶 T7DNA聚合酶的化学修饰 去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。修饰后的T7 DNA聚合酶的用途lSanger双脱氧链终止法对长片段DNA进行测序的理想用酶 l标记DNA 3隐蔽末端l 更有效地补平末端（6）Taq-DNA聚合酶具有耐95左右高温达30min以上的特性； 催化53的DNA新链合成，最适温度6872，合成速度1200bases/min；在合成的DNA链的3端常多一个“A”；不具35的外切酶活性,即无校正功能，大约每合成500个碱基要错配一个；具微弱的53的DNA外切酶活性。（7）pfu聚合酶v具有耐95左右高温达30min以上的特性； v催化53的DNA新链合成，最适温度6872，合成速度600bases/min；v合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A；v合成的DNA片段长度在2kb以内；v具35的外切酶活性,即有校正功能；v无53的DNA外切酶活性。（10）依赖于RNA的DNA聚合酶反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链M-MuLV:鼠源RT, 来源于鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)最适温度42, 以RNA、DNA或RNADNA杂分子为模板，需引物，需Mg2+或Mn2+为辅助因子，具有RNase H活性，特异性地对RNADNA杂分子中的RNA降解禽源RT, 来源于鸡成髓细胞增多症病毒(Avian Myeloblastosis virus) （特点同上）Powerscript Reverse TranscriptaseCLONETECH公司的专利产品，源于M-MuLV的一个点突变。无RNase H活性，故合成的cDNA不会因此变短。具有末端转移酶活性，倾向加3个“C”。用于合成全长cDNA。核酸酶核酸酶，切割双链DNA，不能降解突出3末端，可降解平末端。绿豆核酸酶，降解单链DNA，3和5都能降解，产生平末端。Bal31核酸酶，单链内切双链外切的核酸酶，3和5末端切割速度不同，可产生粘性末端。S1核酸酶，切割单链RNA和单链DNA，降解由限制性内切酶切割形成的3或5突出末端，切割双链中未配对的单链区域，低浓度切割单链，高浓度可切割双链。限制性内切酶命名限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 + 种名 + 株名的个一个首字母，再加上序号，A、 第一个字母大写，表示该酶来源的细菌属名的第一个字母B、 第二、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前2个字母C、第四个字母 大写 代表不同的变种/品系 小写 代表不同的菌株和型 D、最后罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶 注意限制性内切酶的正确写法：1、前3个字母一定斜体 2、字母与罗马数字间空格 如：EcoR I Pst I影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等解决方法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶；加大反应总体积，延长反应时间。 DNA甲基化程度 反应条件高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Star activity现象。EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%，可切割5PuPuATPyPy3酶的纯度酶切反应的温度和时间大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如Sma I 为25度。酶解时间可以通过加大酶量而缩短。星号活性: 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为同裂酶: 识别相同序列的限制性内切酶称为。它们的切割位点可能不同同序同切酶: 识别序列和切割位置都相同同序异切酶（Isoschizomer): 识别序列相同，但切割位点不同同功多位酶：许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能同尾酶（Isocaudarner）:不同的限制性内切酶切割DNA产生的末端是相同的，切是对称的，即相同的粘性末端DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶需要 NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体DNA连接酶以ATP作为辅助因子；不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端；RNA:DNA杂交分子中RNA上的缺口。连接条件必须是两条双链DNA。DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。需要能量动物或噬菌体中：ATP ；大肠杆菌中：NAD+只能连接相邻核苷酸之间的缺口，不能连接gap，可以连接nick。核酸修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶 53DNA聚合酶活性末端转移酶的特性：需要3OH、二甲胂酸缓冲液。不需要模板。底物可以是单链DNA是3OH突出的双，随机添加的dNTPs，如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。末端转移酶的用途：同聚物加尾：给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。再生酶切位点：便于回收克隆片断。非放射性标记DNA片断的3端：催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。（生物素-11-dUTP等）2.T4多核苷酸激酶功能：催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。（不论5-OH端突出与否）。如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。多核苷酸激酶的用途：正向反应（forward reaction）和交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的32P与DNA5端的磷酸交换。3. 碱性磷酸酶可催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5磷酸变为5-OH末端。可防止载体自链。基因克隆载体载体载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制。理想载体条件 ：（1）具有较小的分子质量和较高的拷贝数（2）具有若干限制性内切酶的单一酶切位点，以满足基因克隆的需要（3）具有合适的筛选标记（4）容易在宿主细胞中分离纯化（5）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（6）能在宿主细胞中独立复制克隆型载体：复制和扩充重组DNA为目的，以获得更多重组DNA,也称扩增型载体。表达型载体：在宿主细胞中表达外源基因为目的，获得足够的表达产物蛋白质或RNA。质粒质粒（plasmid）是存在于细胞中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。质粒的特点：A: 质粒是能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；B: 质粒常见于原核细菌和真菌中；C: 绝大多数的质粒是DNA型的(酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒)；D: 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；E: 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb。编码23个蛋白质；F：编码一些非染色体控制的遗传性状，对宿主非必须，但可赋予宿主额外遗传特征。G：对抗生素的抗性是质粒最重要的编码特性之一。质粒具有三种构型： 共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈超螺旋的SC构型，其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，电泳速度最快。 开环DNA（ocDNA），即OC构型，两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，电泳速度居中。 线性DNA，即L构型。质粒DNA经适当的核酸内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子，电泳速度最慢。质粒不亲和性（plasmid incompatibility），也称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。典型质粒：F因子，Col质粒，R质粒，Ri质粒，Ti质粒等。1)F质粒:又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。F质粒，又称F因子，即致育因子,在寄主细胞中以三中不同的形式存在：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA片段，这样的细胞称为F+细胞;.以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上携带有细菌的染色体基因或DNA片段，这样的细胞称为F细胞:以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞称为Hfr细胞（高频重组细胞）2).R质粒:通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力3) .Col质粒:即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。重要的大肠杆菌质粒载体（图谱的元件组成自己动手画一下）（1）pBR322:松弛型复制；氯霉素可扩增；拷贝数 50 - 100 / cell；用于基因克隆。a.元件来源： 复制起点 ori：pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点； Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因； Tetr基因：pSC101的Tetr 基因。b.选择标记:氨苄青霉素和四环素抗性c.pBR322的优点: 双抗菌素抗性选择标记：插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大：载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy安全：失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。（2）pUC18 / 19(P43)：拷贝数 2000 - 3000 / cell；装有多克隆位点（MCS）；正选择颜色标记 lacZ；用于基因克隆和测序。a.元件来源: 复制起点:pBR322的 ori Ampr 基因:pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。 lacZ的启动子:大肠杆菌 lacZ基因:大肠杆菌lacZ的-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。b.正选择标记： lacZ 的显色原理:-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。-肽（ lacZ ）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.;受体菌lacZ突变（lacZM15）：受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 载体lacZ与互补：pUC质粒载体上的lacZ编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。互补的插入失活：pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。c.IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZa肽都表达。从而互补。d.pUC系列载体的优点： 更小的分子量； 选择方便:Xgal显色、抗菌素双重直接选择； 克隆便利:具有多克隆位点（MCS）； 测序方便-互补：LacZ基因编码的-肽链是-半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生有功能活性的-半乳糖苷酶分子。于是便可以应用X-gal和IPTG显色技术检测转化子。重组子为白斑，非重组子为蓝斑（3）pGEM-3Z由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录pGEM-3Z的特点：如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA； 外源基因正接反接都可以转录； MCS与pUC18的完全一样噬菌体载体M13噬菌体M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制。其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针，也可以进行盒式定点诱变。M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒（一出芽方式），宿主细胞仍能继续生长和分裂。获取单链，离心去上清即可，获取双链，离心，取菌体提取质粒即可。M13系列载体的优点（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段。（2） X-gal显色反应，可供直接选择。（3）无包装限制，克隆能力大。（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA）。M13载体的缺点 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。 实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。噬菌噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，能以两种不同的方式繁殖：溶菌性方式和溶原性方式。DNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。噬菌体整个基因组可分为三个部分，左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：长约20kb，是DNA整合和切出，溶原生长所需的序列。右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。噬菌载体利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：设计去除DNA上的一些限制性酶切点。在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ序列，和多克隆位点等。由此可构建出两类噬菌体作载体：一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的gt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型噬菌体基因组105%或小于75%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以噬菌体载体可插入长9-23kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。包装限制：噬菌的多连体DNA进行切割包装时，两个相邻cos位点之间的DNA长度是野生型噬菌基因组的75%105%时，才能够包装成有活性的噬菌体颗粒的现象称为包装限制。如果将左右臂和中段都去除，仅留下DNA两端端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。噬菌粒载体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。噬菌粒载体的特点a.能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 ；b.能像质粒那样在受体细胞中自主复制；c.装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）；d.通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA；e.重组操作简便，筛选容易；f.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；g.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤克隆的策略克隆的一般步骤1）目的基因的分离；2）表达载体构建；3）重组DNA导入宿主；4）转化子的筛选；5）转基因的鉴定（是否整合以及整合位点，是否转录及转录水平，是否表达及表达水平，是否有表型，蛋白是否有活性）。基因组文库基因组文库是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。基因组文库的构建过程：1）从生物体提取大片断的基因组DNA；2）用适当的限制性内切酶（常为4碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组DNA ；3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的DNA片断（根据载体的要求）； 4）载体的酶切、回收；5）将处理好的基因组DNA片断与载体连接；6）将重组子导入宿主细胞7）文库的鉴定、收集、保存；确定文库大小的方法：以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所含克隆数N（即文库大小）之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中， N：文库所需的总克隆数；P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小。cDNA文库cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入受体菌细胞中进行保存和扩增，由此得到的含有重组子的全部菌落集合。cDNA文库构建的一般步骤：（1）总RNA（total RNA）提取（2）mRNA的分离纯化（3）cDNA的合成： cDNA第一链合成和cDNA第二链合成（4）cDNA与载体连接：在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端，再与载体连接。（5）转化受体菌，并挑选阳性克隆SMARTTM cDNA文库构建方法的特点：1）两个接头引物；2）依赖末端转移酶活性在cDNA第一链3末端加多聚胞嘧啶核苷酸C；3）引物上含有稀有酶切位点；4）用长链PCR扩增产物，初始的总RNA含量要求低。基因组文库与cDNA文库的区别：1）来源不同：基因组文库是由基因组DNA构建的，而cDNA文库是由生物体表达的基因的mRNA逆转录合成的DNA构建的；2）代表性不同：基因组文库包含生物体所有基因，cDNA文库只包含生物体部分基因（表达的基因）；3）含有信息不同：基因组文库包含生物体基因的全部信息（包括编码序列和调控序列，重复序列以及“垃圾DNA”等所有序列），而cDNA文库只包括基因的ORF，以及上下游非编码序列；4）均一性文库不同：基因组文库大小较均一，而cDNA文库大小不均一；5）载体不同：基因组文库用YAC,BAC,PAC,cosmid等，而cDNA文库用质粒和噬菌粒载体等；6）构建方式不同：基因组文库直接酶切即可，cDNA文库需要逆转录合成DNA。YAC酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)酵母人工染色体包含3个关键序列：自主复制DNA序列（autonomously replicating sequence，ARS）ARS的功能是确保染色体在细胞周期中能够自我复制着丝粒DNA序列（centromere DNA sequence, CEN） 确保复制的染色体能够平均分配到子细胞中端粒DNA序列（telomere DNA sequence，TEL） 与端粒酶结合，完成染色体的末端复制。pYACs的一般元件：ARS，CEN，TEL，Ori，抗生素标记，营养缺陷标记，sup4，MCS（多克隆位点），适宜的酶切位点。sup4标记插入失活筛选原理：载体携带有sup4，即赭(zhe,三声)石突变抑制基因，受体菌是带有一个赭石突变ade2-1。当这种酵母菌在基本培养基上生长时，没有插入外源基因的空载体上的sup4可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落；而有外源基因插入时，sup4失活，ade2-1突变效应出现，使菌落呈现红色。YAC优缺点：优点：克隆容量大缺点：片段大，稳定性差，不便操作；文库中的嵌合现象严重；有缺失和基因重排现象。嵌合现象（chimaerism）是指一个YAC克隆中的DNA片段来自两个或两个以上的染色体。BAC（略）PAC（略）染色体步移：利用已知基因或DNA分子标记来分离与其紧密连锁的未知基因的有效方法，其原理是重叠克隆可以相互杂交，使它们与邻近序列重叠。SAGE基因表达系列分析（SAGE）是通过快速和详细分析成千上万个EST（express sequenced tags）来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。SAGE的优点和应用首先SAGE可应用于基因组研究。其次，SAGE可用于定量比较不同状态下的组织细胞的特异基因表达。第三，由于SAGE能够同时最大限度的收集一种基因组的基因表达信息，转录物的分析数据可用来构建染色体表达图谱筛选策略Spi表型筛选噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在P2溶源化的大肠杆菌中正常生长，致使带有这两个基因的野生型噬菌体感染P2溶源化的大肠杆菌后不能形成噬菌斑，称为敏感型Spi-（sensitive to P2 prophage inhibition），也称超抑制。置换型载体的可置换片段中放上red和gam基因，为Spi-，不能形成噬菌斑；而外源DNA片段取代了置换片段，就会同时除去red、gam基因，载体变为Spi+，体外包装成有活性的噬菌粒后，能形成噬菌斑。通过挑选能够在P2溶源化的大肠杆菌中形成噬菌斑的克隆即为阳性克隆。噬菌体的限制包装筛选：见上文。互补筛选（lacZ）：蓝白筛选，见上文。核酸杂交筛选文库筛选使用最广泛，多采用原位杂交技术（包括菌落原位杂交和噬菌斑原位杂交）和PCR筛选。探针筛选探针设计：基于已知序列；其它物种中同源基因序列；基因保守区序列；由蛋白质序列合成简并探针；探针标记（注意加入的核苷酸类型）5末端标记：碱性磷酸酶和核苷酸激酶，加入-32P-ATP。3末端标记：单链，用末端转移酶，加入-32P-ddATP；双链标记，用DNA聚合酶和限制性内切酶，加入-32P-dATP和dNTPs。均一性标记：加入随机六聚体引物，T7DNA聚合酶，-32P-dATP和dNTPs。单链RNA标记：利用pBluescript，体外转录标记，加入T7RNA聚合酶，-32P-ATP和NTPs。无探针筛选差别筛选，抑制性消减杂交表达文库的筛选免疫化学筛选抗体筛选，条件：基因序列未知，蛋白质易纯化。一般步骤：构建基因组表达文库；制备抗体；文库涂平板（与菌落原位杂交相似）；影印到膜上（转移蛋白质）；抗体洗脱。功能克隆根据DNA所表达的蛋白质生物学功能来确定序列，通过反义PCR来扩增cDNA，再进行对片段序列进行研究的一种方法。蛋白质功能筛选：功能互补筛选：用特殊的DNA序列补偿突变细胞内缺失的功能，使细胞恢复到野生型表现型的筛选方法。酶底物筛选DNA-蛋白质筛选克隆基因在大肠杆菌中的表达原核生物基因表达的特点1）只有一种聚合酶，识别原核生物启动子；2）有操纵子结构；3）转录与翻译同时进行，无时空特异性；4）基因没有内含子，缺乏对应的转录后加工系统；5）mRNA上有SD序列，可以和核糖体RNA3末端碱基互补配对。原核表达真核基因的困难和解决方法困难：细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；真核基因转录的mRNA缺乏SD序列，在原核细胞中不能结合到核糖体上；真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，不能表达出有功能的真核蛋白；表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏；外源蛋白多数对宿主有毒性；原核生物没有糖基化修饰系统，不能表达糖基化蛋白质。方法：真核基因的启动子换为原核的启动子在基因ORF上游加上SD序列；用cDNA基因来表达；融合表达，在外源基因上加上一段原核生物的序列；采用诱导性表达；改换表达系统，可用真核酵母表达外源蛋白质。原核生物启动子特点-10区（TATAAT）-35区（TTGACA）-10区和-35区间的距离（最适为17bp）常用的启动子Plac（乳糖启动子）Ptrp（色氨酸启动子）Ptac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）PT7（T7噬菌体启动子）PL和PR（噬菌体的左向和右向启动子）。目的基因的获取方式：PCR，文库筛选，化学合成外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理（小字内容为详细解说，供扩展知识用）（1）启动子启动子的构建Ptac = -35Ptrp + -10 Plac启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性：野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5色氨酸启动子Ptrp的可控性：色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达。噬菌体启动子PlL的可控性：噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋在42时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达（2）终止子强化转录终止的必要性：外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用 终止子也可以像启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。（3）核糖体结合位点（SD序列）外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。核糖体结合位点的结构A. Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3， 它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译B. 翻译起始密码子：绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为