酶工程复习 (2).doc

1.酶工程:酶的生产、改性及与应用的技术过程2.核酶(Ribozyme)：具有催化活性的RNA3.酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质和RNA）4.酶的绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性叫酶的绝对专一性 酶的相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性5.活化能：在一定的温度条件下，1摩尔的初态分子转化为活化分子所需的自由能称为活化能6.竞争性抑制（Competitive inhibitiion）:抑制剂与底物分子竞争与酶分子结合引起的抑制作用。 非竞争性抑制(Noncompetitive inhibition):抑制剂与底物分别与酶分子上的不同结合位点，引起酶活性降低的抑制作用 反竞争性抑制（Uncompetitive inhibition):在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合引起抑制作用7.酶活IU：在特定条件下，每1min催化1umol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。 转化数：又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。 催化周期：转化数的倒数，也指酶进行一次催化所用的时间。8.酶的生物合成：酶在生物体内合成的过程称为酶的生物合成。 酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需酶的技术过程。9.转录(Transcription);转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在依赖DNA的RNA聚合酶转录酶）的作用下，生成RNA的过程。翻译(Translation)：以mRNA为模板，以各种氨基酸为底物，在核糖核蛋白体上通过各种tRNA、酶、和辅助因子的作用，合成多肽链的过程10.组成型酶（Constitutive enzyme）：在细胞中的量比较恒定，环境因素对其合成速率影响不大的一类酶 适应型酶( Adaptive enzyme) 或调节型酶(Regulated enzyme)：在细胞中的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响的一类酶11.操纵子学说（Operon theory）：转录水平的调节，又称基因的调节。这种调节理论是由雅各和莫若德于1960年提出的。根据基因调节理论，在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有4种：调节基因、启动基因、操纵基因、结构基因启动子（Promoter）：启动子是位于结构基因5端上游的一段DNA序列，能够指导全酶同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。12.端粒（Telomere）：真核生物染色体的末端结构，由富含G和T的DNA的简单重复序列不断重复而成。端粒酶（Telomerase）：催化端粒合成和延长的酶，是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分，其RNA组分中含有构建端粒重复序列的核甘酸模板序列。13.动、植物细胞培养：通过特定技术获得优良的动植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需产物的过程14.酶的提取和分离纯化：将酶从细胞及其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。15.层析（chromatography）：层析法又称色谱法。利用混合液中各组分的物理化学性质（如分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布两相中。16.电泳（Electrophoresis）：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。17.不连续PAGE凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳的一种。采用2层或3层性质不同的凝胶（样品胶、浓缩胶和分离胶）重叠起来使用，采用两种不同ph值和不同的缓冲液，使浓度较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率的电泳方法。18.双水相萃取：双水相萃取的两相分别为互不相容的两个水相，利用溶质在互不相容的水相中溶解度不同而达到分离。19.超临界萃取：是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。20.反胶束萃取：利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。反胶束又称反胶团，是表面活性剂分子分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。21.酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特征和功能的技术过程称为酶分子修饰22.定点突变（Site directed mutagenesis）：在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。23.抗体酶（abzyme）：又称为催化性抗体（catalytic antibody），是一类具有催化功能的抗体.24.固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶成为固定化酶。25.非水酶学（non-aqueous enzymology）：包括非水介质（包括有机溶质介质、超临界流体介质、气相介质、离子液介质等）中的酶的结构与功能、非水介质中的酶的作用机制，非水介质中酶催化动力学等方面研究的理论体系26.酶的非水相催化：酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化27.微水介质体系：由有机溶剂和微量的水相组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系28.极性系数l gP：表示有机溶剂极性强弱的系数。（P指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表示其极性越小）29.ph印记：在有机介质反应中，酶所处的的ph环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液ph值相同的现象30.酶的定向进化：模拟自认进化过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。31.酶反应器：用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。知识点：1. 酶工程的内容 微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用。2酶的发展史P2 1878年Kuhne首次将.酵的物质称为酶。 1902年Henri根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果,提出中间产物学说。 1913年Michaelis和Menten根据中间产物学说,推导出酶催化反应的基本动力学方程米氏方程。 1926年Sumner首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶,并证明它具有蛋白质性质。 1960年Jacob和Monod提出操纵子学说,阐明了酶生物合成的基本调节机制。 1982年Cech等发现四膜虫细胞的26SrRNA前体具有自我剪接功能。3酶催化作用的特点 专一性强、催化效率高、作用条件温和4.影响酶催化作用的因素(详细了解)P5 (1)底物浓度S:决定酶催化反应速度的主要因素。在底物浓度较低的情况下,酶催化反应速度与底物浓度成正比,反应速度随着底物浓度的增加而加快;当底物浓度达到一定的数值时,反应速度的上升与底物浓度不再成正比,而是逐步趋向平衡。 (2)酶的浓度E:在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速度与酶浓度成正比。 (3)温度:每一种酶的催化反应都有其适宜的温度范围和最适温度。在适宜的温度范围内,酶才能够进行催化反应;在最适温度条件下,酶的催化反应速度达到最大。 (4)pH:每一种酶都有其各自适宜的pH范围和最适pH。只有在适宜pH范围内,酶才能显示其催化活性。在最适pH条件下,酶催化反应速度达到最大。 (5)抑制剂:能够使酶的催化活性降低或丧失。 (6)激活剂:能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来。5.米氏方程:阐明了底物浓度与酶催化反应速度之间的定量关系.vVmaxS/(Km+S)Km 值称为米氏常数,为酶催化反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度;Vmax是最大反应速度,S为底物浓度.6. 三种抑制作用的特点 竞争性抑制:酶催化反应的最大反应速度Vmax不变,而米氏常数Km增大.非竞争性抑制:最大反应速度Vmax减小,而米氏常数Km不变.反竞争性抑制:最大反应速度Vmax和米氏常数Km同时减小.7.六大类酶 氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 连接酶（合成酶）8. 酶活力测定的基本步骤，终止酶反应的方法 步骤： 根据酶催化的专一性,选择适宜的底物,并配制成一定浓度的底物溶液. 根据酶的动力学性质,确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件 在一定的条件下,将一定量的酶液和底物溶液混合均匀,适时记下反应开始的时间. 反应到一定的时间,取出适量的反应液,运用各种生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量. 方法：反应时间一到,立即取出适量反应液,置于沸水浴中,加热使酶失活. 加入适宜的酶变性剂,使酶变性失活.如三氯醋酸等. 加入酸或碱溶液,使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH值,使反应终止. 将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中,使反应液的温度迅速降低至10度以下而终止反应。9. 酶的三种生产方法 提取分离法、生物合成法、化学合成法10.产酶微生物应具备的条件：酶的产量高、产酶稳定、容易培养和管理、利于酶的分离纯化、安全可靠，无毒性。 11. 微生物的培养方法 固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物原生质体发酵、固定化微生物细胞发酵12中心法则（Crick提出） 13 氨酰-tRNA合成酶的特点P29 具有识别氨基酸和识别其对应的t-RNA的功能 酶生物合成的调节控制包括的方面(1)分解代谢物阻遏作用;(2)酶生物合成的诱导作用;(3)酶生物合成的反馈阻遏作用。15.分解代谢物阻遏作用(又叫葡萄糖效应)，酶生物合成的诱导作用和反馈阻遏作用定义:指某些物质(主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源)分解代谢的产物阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成的现象.原因:细胞内ATP浓度增加,就使AMP的浓度降低.存在于细胞内的cAMP就通过磷酸二酯酶的作用水解生成AMP. cAMP合成受阻,导致细胞内cAMP浓度降低.使cAMPCAP的复合物的浓度随之降低. 结果:启动基因的相应位点上没有足够的cAMPCAP的复合物结合,RNA酶无法结合到其启动基因的相应位点上,无法转录,酶的生物合成受阻. 实质:cAMP通过启动基因对酶生物合成的调节控制. 应用:在培养微生物时,控制好某些容易降解物质的量,或在必要时添加一定量的cAMP,均可减少或解除分解代谢物阻遏作用. 酶生物合成的诱导作用:定义:加入某些,使酶的生物合成开始或加速进行的现象,称为酶的生物合成的诱导作用,简称诱导作用. 原因:诱导物与阻遏蛋白结合,使之构象变化,不能结合在操纵基因上.结果:RNA转录酶发挥作用,结构基因转录并翻译.实质:诱导物使阻遏蛋白构象变化,不利于结合到操纵基因上.应用:添加诱导物到培养基中,使目标酶合成量提高.例 1、半乳糖苷酶的生物合成 诱导物:乳糖(底物)、异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)(底物类似物); 2、 蔗糖酶合成的诱导物:蔗糖(底物)、 蔗糖甘油单棕榈酸酯(底物类似物) 反馈阻遏作用:定义:指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象.原因:引起反馈阻遏作用的物质称为共阻遏物 .由阻遏物和代谢终产物结合成.阻遏物单独存在时,活性低,不能结合到操纵基因上,共阻遏物能结合到操纵基因上.结果:RNA聚合酶无法滑过操纵基因,转录、翻译无法进行.实质:阻遏物与终产物结合成共阻遏物,并结合在操纵基因上.应用:发酵产酶过程中,及时将终产物分离出来.例:无机磷酸,是碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解的产物,它的过量存在,会阻遏碱性磷酸酯酶的生物合成.色氨酸,是色氨酸合成途径的终产物,它的过量积累反过来会对其合成途径中的4种酶色生物合成.16. 端粒酶作用机制是催化端粒合成和延长的酶。是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分，其RNA组分中含有构建端粒重复序列的核苷酸模板序列。在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分作为模板，把端粒重复序列加到染色体DNA的末端，使端粒延长。17 体酶制备方法及原理 方法：修饰法（对抗体分子进行分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引入催化基团，使其成为具有生物催化活性的抗体）。诱导法（为抗体酶制备的主要方法，是在特定的抗原诱导下合成抗体酶的方法。根据所采用的抗原的不同，分为半抗原诱导法和酶蛋白诱导法） 原理:在抗体的可变区赋予酶的催化特性，就有可能变成抗体酶 。17. 发酵工业条件及控制P43 细胞的活化与扩大培养、培养基的配制、pH的调节控制、温度的调节控制、溶解氧的调节控制、提高酶产量的措施19.酶工程合成的四种模式及特点 同步合成型是指酶的合成与细胞生长同步进行，即开始点与结束点一致。延续合成型：指酶的合成与细胞生长开始点相同，但细胞不生长了，酶还可以延续合成一段较长时间，即终止点不同。中期合成型：指细胞生长一段时间后，酶合成才开始，即开始点不同，细胞生长停止后，酶生物合成也随之停止，即终止点相同。滞后合成型：指细胞生长一段时间后或进行平衡期以后才开始酶的合成，细胞停止生长后，酶的合成还未停止，即开始点与终止点都不同。20. 植物细胞培养的一般工艺流程 外植体获取细胞获取细胞培养分离纯化产物21. 影响酶的提取的主要因素 温度（010）;pH值（一般偏离等电点（pI） 1个pH单位); 提取液的体积（一般为原料体积的35倍，最好分几次提取）22. 常用的沉淀分离方法 盐析沉淀法（ 注意分段盐析过程中，蛋白质析出的顺序）;等电点沉淀法; 有机溶剂沉淀法; 复合沉淀法; 选择性变性沉淀法 23. 过滤的分类 (1)非膜过滤 粗滤:截留的颗粒大小2um,截留的主要物质为酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞,过滤介质为滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属 ; 微滤:截留颗粒大小0.22um(细菌、灰尘),过滤介质为微滤膜、微孔陶瓷 (2)膜过滤 超滤:截留颗粒大小20A0.2um(病毒、生物大分子),过滤介质为超滤膜; 反渗透:截留颗粒大小2OA(生物小分子、盐、离子),过滤介质为反渗透膜。24. 离子交换层析和凝胶层系的差别 相同：它们都利用混合液中个组分的化学、物理性质的不同，使各组分以不同比例分布在两相中，当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。不同：操作过程都有装柱、平衡、上样、洗脱和收集，但离子交换层析还有再生最后一步，使离子交换剂恢复原状，以便重复利用，但凝胶层析没有“再生”步骤。25. 影响电泳泳动率的因素 电场强度(常压电泳（100500V）、 高压电泳( 50010000V)溶液的pH值（偏离pI ）、溶液的离子强度（最适离子强度为0.020.2)/电渗(在电场中，液体相对于固体支持物的移动称为电渗)26. 聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳的原理和分类，PAGE凝胶的组成 (1)原理:不同物质由于带电荷数、颗粒大小、性状不同,在一定的电场中移动方向和速度的不同,故可使它们分离。(2)分类:按其凝胶形状和电泳装置的不同,分为:垂直管型盘状凝胶电泳、垂直板型片状凝胶电泳。按其凝胶组成系统不同,可分为:连续凝胶电泳;不连续凝胶电泳;梯度凝胶电泳;SDS-凝胶电泳。(3)组成:单体：丙烯酰胺（Acr）交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）催化剂：过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）27. SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其迁移率主要决定于它所带电荷以及分子的大小和形状。但是，当加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，而与它的形状及所带电荷无关。 28. 等电点聚焦电泳原理 在电泳系统中,加入两性电解质载体.当通以直流电时,两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度.当蛋白质或多肽进入这个系统时,不同的蛋白质即移动到与其等电点相当的pH位置上,从而使不同等电点的蛋白质得以分离.这种电泳技术称为等电点聚焦(isoelectric focusing)电泳.29. 双向电泳和琼脂糖凝胶电泳 双向电泳双向电泳的第一向为等电点聚焦电泳,而第二向为SDS-PAGE电泳.即将等电点聚焦的胶条或管状凝胶放在SDS-PAGE凝胶上根据蛋白质分子量进行电泳分离.样品经过电荷和质量两次分离后,得到等电点和分子量的信息,电泳的结果不是条带,而是点.注意:第二向SDS-PAGE前应将等电聚焦凝胶在SDS溶液中预先平衡. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中分离得到的,而琼脂可以从海藻中提取,琼脂由琼脂糖和琼脂胶组成.琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷.琼脂糖凝胶电泳用于分离、鉴定和提纯DNA片段.30. 双水相萃取、超临界萃取以及反胶束萃取双水相萃取的两相分别互不相容的两个水相，利用溶质在两个互不相容的水相中的溶解度不同而达到分离。超临界萃取物质在不同温度（T）和不同压力（P）的条件下，有不同的形态：固体（S）、液体（L）、气体（G）、超临界流体（SCF）。反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。31.酶分子修饰的目的 提高酶的活性、增强酶的稳定性、降低酶的免疫原性、阐明结构与功能的关系32. 金属离子置换修饰的过程 酶的分离纯化、除去原有的金属离子、加入置换离子33.侧链修饰的各种方法 大分子修饰、小分子修饰、双功能基团化合物修饰34. 定点突变的主要过程 1.对待突变基因测序结果进行分析，设计突变方案； 2.根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应； 3.默认情况下，将PCR产物克隆至T载，或者根据要求亚克隆至目的载体；DNA测序验证突变序列的正确性。35. 固定化酶的目的 提高稳定型，反复使用，提纯36.固定化酶的方法吸附法、包埋法、 结合法、交联法、热处理法37. 生物传感器的构成 生物传感器 （Biosensor）：是一种具有专一、灵敏、快速、简便、准 确的分析测试混合物溶液中某种物质浓度的装置。由感受器（又称为分子识别元件，由生物活性物质与固相载体结合而成。能通识混合物中的目标物质产生的物理或化学变化而产生化学信号或物理信号而被识别)跟换能器（能将上述化学信号转变成电信号，并经过放大、数据处理、最后测出混合物浓度）构成。1. 细胞固定化的方法 (1).吸附法; (2).包埋法:琼脂凝胶包埋法,海藻酸钙凝胶包埋法,角叉菜胶包埋法,明胶包埋法,聚丙烯酰胺凝胶包埋法1. 酶非水相催化中非水体系的分类 有机介质中的酶催化、气相介质中的酶催化、超临界流体介质中的酶催化、离子液介质中的酶催化40.有机介质中体系的分类微水介质体系、与水溶性有机溶剂组成的均一体系、与水不溶性有机溶剂组成的两项或多项体系 、正胶束体系、 反胶束体系41. 最适水量和最适水活度与有机溶剂极性的关系 最适水含量随着溶剂极性的增加而增加,而最适水活度与溶剂极性大小没有关系。42. 有机溶剂的选择要求 2lgP543. 有机介质中酶催化的应用 ( 手性药物的拆分、HRP的应用、天苯肽和生物柴油)手性药物的拆分:可生物降解的聚酯的合成;可用于糖酯的合成。HRP的应用:可催化苯酚等酚类物质聚合生成酚类聚合物;可用于环保型树脂的合成、导电、发光有机聚合物的合成。天苯肽:用作食品甜味剂。生物柴油:可代替柴油作为发动机的燃料。44. 酶定向进化的一般步骤 随机突变、构建突变基因文库、定向选择45.酶定向进化中突变基因获得的方法 (1)易错PCR技术(2)基因重排技术:交错延伸PCP技术、随机引物体外重排技术(3)基因家族