材料合成与制备方法--课后作业.docx

麻醉药与脂筏相互作用摘要麻醉剂诱导细胞膜介导的修饰的机制仍然是一个悬而未决的问题。 尽管麻醉分子在细胞膜上的流化作用被广泛认同，但是尚不知道麻醉剂是否显示出对特定膜结构域的作用，即脂筏。 这些膜微结构域的重要性来自于它们与细胞信号传导途径以及特异性药物相互作用相关联的事实。 这项工作的目的是通过比较麻醉剂与各种脂质组成的膜的相互作用来说明这个问题。选择用POPC，鞘磷脂和胆固醇等摩尔混合物制备的脂质体作为脂筏的模型。研究了这些脂质体与两种局部麻醉剂，丁卡因、利多卡因和一种全身麻醉剂异丙酚的相互作用。通过比较与POPC / SM脂质体和POPC / SM / CHOL脂质体的麻醉相互作用来研究胆固醇的作用。本试验使用以下实验技术：具有耗散的石英晶体微量天平，差示扫描量热法和磷核磁共振法。虽然在不同的条件和技术手段下研究的脂质体，但是可以从所采用的所有实验技术获得的信息以得出一般结论。丁卡因与筏状结构域更多地相互作用，利多卡因对POPC / SM脂质体诱导更强的修饰，丙泊酚的结果不完全确定，但它似乎是最不容易与脂质相发生互作用。引言虽然麻醉机制已经被研究了多年，麻醉剂与神经细胞膜的相互作用位点仍然是研究的对象。提出这种相互作用的两个主要理论是直接结合蛋白质和围绕功能蛋白质的膜脂质的扰动（Frangopol和Mihailescu，2001; Tsuchiya和Mizogami，2008; Tsuchiya等，2010a，2011）。有证据支持两个假设，脂质相互作用假说是由麻醉效力与细胞膜流化诱导能力密切相关的事实表明的（Boren et al。，2007）。然而，当诱导流化时，不知道麻醉剂是否表现出对特定膜结构域的任何作用。脂筏在生物膜领域最近引起了极大的关注。尽管相对于物理性质甚至脂筏的存在还存在许多未解决的问题（McIntosh，2007），但已经收集了关于它们在与细胞信号传导途径，膜运输和信号转导相关的膜活性中的作用的证据（McMullen等，2004; Heerklotz，2002; Holland等人，2006）。脂筏的修改可能导致像阿尔茨海默病，帕金森病，朊病毒疾病和癌症等疾病（Holland等，2006; Giocondi等人，2004; Patra，2008）。此外，一些药物通过与脂质筏优先相互作用来启动在细胞中的作用（Patra，2008; Ausili等人，2008; Falck等人，2006），而毒素和病原体将其用作优选的进入位点（Holland等， 2006）。脂质筏是在生理温度处于液体有序相（Lo）中的瞬时微畴，其具有在凝胶和液晶相之间的中间特性，与处于流体像液体无序相（Ld）（McMullen等人，2004; Edidin，2003; London，2005; Hanzal-Bayer和Hancock，2007; Almeida等人，2009）。通常，使用高熔点温度（Tm）脂质（与饱和酰基链），低熔点脂质（不饱和酰基链）和胆固醇（CHOL）的三元混合物作为浮筏混合物。鞘磷脂（SM）似乎是最合适的高Tm脂质，因为它能使氢键与胆固醇的羟基结合，并且它存在于许多细胞类型的天然膜上。对于低Tm脂质，一个好的选择是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（POPC），因为它是细胞膜中最相关的磷脂酰胆碱，通过从生物来源提取发现。由POPC / SM / CHOL等摩尔混合物组成的所谓“标准筏混合物”被认为是一种准确的模型（Holland等，2006）。虽然这些混合物具有比细胞膜更简单的脂质组成，但它们的相行为产生了从细胞提取的天然脂筏的相行为相似（Onuki和Takayama，2010）。在这项工作中，研究了几种麻醉剂和脂筏之间的相互作用。 在之前的研究中，Tsuchiya等 （2010b）无法检测到酰胺类麻醉药与脂筏之间的任何优先相互作用。 据我们所知，没有其他研究涉及麻醉和筏状膜。为了模拟这些筏的脂质组成，由三元混合物POPC / SM / CHOL（1:1:1，摩尔比例）组成的单层脂质体。 由于SM和POPC的二元混合物也已知在更加刚性的富含SM的结构域和更加流体的富含POPC的结构域中相分离（Giocondi等人，2004），所以将研究POPC / SM（1：1，摩尔比例）的二元混合物，以了解胆固醇如何影响麻醉/脂质相互作用。使用两种类型的模型膜，这取决于测量技术：在使用差示扫描量热法（DSC）和磷核磁共振（31P NMR）光谱的研究中，在具有耗散的石英晶体微量天平（QCM-D）和悬浮液实验中的脂质体层。使用三种麻醉剂：丁卡因，酯类的局部麻醉剂; 利多卡因，一种局部麻醉剂的酰胺型; 异丙酚，全身麻醉。 表1给出了这些分子的化学结构和pKa值。这些值的分析显示，在中性pH下，丙泊酚具有最高的带电分子浓度，而利多卡因呈现相似百分比的中性和质子化形式。具有耗散的石英晶体微量天平（QCM-D）可以评估由与麻醉剂分子相互作用而引起的支撑脂质体层的质量和粘弹性变化。 氧化金涂层石英晶体在我们的研究中被使用，因为已知目前使用的两性离子脂质体在其表面上完全吸附（Keller和Kasemo，1998; Serro等，2012）。 在脂质体悬浮液中进行比较研究，使用DSC确定麻醉剂对脂质膜的相行为的影响，31P NMR表征麻醉剂对磷脂头部移动性的作用，提供脂质包装和相位的证据共存。这项研究是目前正在我们实验室扩展项目的一部分，它涉及不同类型药物对各种脂质体模型的作用。 在以前的研究中（Paiva et al。，2012），1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC），1,2-二棕榈酰 - 甘氨酸-3-磷酸胆碱（DPPC）和胆固醇的单层脂质体用作真核细胞膜的模型来研究与一组麻醉剂的相互作用。 本研究的主要目的是为了了解脂质筏在细胞膜中的作用，作为麻醉作用的优选位点。材料和方法材料从Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL，USA）获得脂质鞘磷脂（脑SM，猪）和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）。 胆固醇（CHOL），盐酸丁卡因，盐酸利多卡因一水合物，2,6-二异丙基苯酚（丙泊酚），缓冲液N-（2-羟乙基）哌嗪-NO-（2-乙磺酸）（HEPES），氯仿和二甲基亚砜 DMSO）由Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA）提供。 氯化钠，甲醇和Extran、 MA 01从Merck KGaA（德国达姆施塔特）获得。 所有试剂按原样使用。 所有实验都使用Milli-Q水。用于固定的基材是由黄金涂覆的AT-cut 5MHz压电石英晶体（直径14mm），由Q-Sense（Gothenburg，Sweden）提供。 用于挤出脂质体的聚碳酸酯过滤器来自Nuclepore，Whatman（Kent，United Kingdom）。方法脂质体的制备 溶解在氯仿和氯仿的混合物中加入适量的POPC，SM和CHOL POPC / SM / CHOL（1:1:1摩尔比）和POPC / SM（1:1摩尔比例）制备多层囊泡（MLV） 甲醇（4:1v / v）。 对于QCM-D和DSC实验，稀释后的最终脂质浓度为1.12mM，对于31P NMR实验为50mM。在氮气流下干燥样品后，将所得膜保持在真空下至少3小时以除去所有痕量的有机溶剂。然后，在65的恒温水浴中，用N-（2-羟乙基）哌嗪-NO-（2-乙磺酸）（HEPES）水合该膜。加热与涡旋搅拌交替1小时。在上述温度下，将所获得的MLV分别在液氮和水浴中进行五次冻融循环。在相同温度下，通过在不锈钢自制挤出机中挤出，从MLV获得大的单层囊泡（LUV）。在惰性氮气氛下，将样品通过孔径减小（600nm，5倍; 200nm，5次; 100nm，10次）的聚碳酸酯滤膜进行几次。最终样品的pH为7.3。将脂质体分散体储存在5，并在制备后1周内使用。使用Avanti Polar Lipids（Avanti Polar Lipids，2012）的方案测定脂质体悬浮液的有效磷浓度。动态光散射（DLS）用于确定挤出的脂质体的大小分布。 实验使用Spectra Physics模型127 He-Ne激光（632.8nm，35mW）和具有BI-200SM测角仪的Brookhaven仪器，BI-2030AT自相关器和APD检测器在25下进行。 时间相关函数通过使用CONTIN方法的拉普拉斯反演进行分析（Manders等，1993）。 POPC / SMCHOL脂质体的挤出囊泡尺寸分布为13623 nm，POPC / SM为11225 nm。麻醉药物的溶解丁卡因和利多卡因的溶液在缓冲液HEPES中制备，浓度为5,125和25mM，用于丁卡因，35和69mM用于利多卡因。 这些麻醉剂的溶液的最大浓度是药物制剂中存在的最大浓度：分别为丁卡因B.Braun Medical，Lda和利多卡因2B.Braun Medical，Lda。通过先前将药物溶解在DMSO中制备丙泊酚溶液，然后加入缓冲液HEPES，以产生1mM的最终异丙酚浓度和0.5（v / v）的DMSO溶液。 选择麻醉剂浓度是因为超过该值，红细胞膜的微粘度显着降低，最终报道了膜的部分溶血（Bahri等，2007）及以下，没有检测到其效果。对于DSC和31P NMR实验，在测试之前将麻醉溶液加入到脂质体悬浮液中。石英晶体微量天平使用具有耗散性的Q-Sense石英晶体微量天平（型号E4）。 实验在37进行，结果是至少四次独立测量的平均值。 对于每种麻醉剂的最高浓度，进行25下的另外的实验。 在测量之前，将所有QCM-D平衡部分在Extran的10碱性清洁溶液中超声处理5分钟，然后在Milli-Q水中超声处理2次，然后用氮气吹干。 根据相同的方案仔细清洁石英晶体。 然后，在使用前立即进行两次连续的10分钟UV /臭氧处理，用Milli-Q水冲洗分离。数据的粘弹性建模使用Voigt-Voinova模型对单层吸附的脂质体进行软件QTools 3（Voinova等，1999）。 参数：粘度（Pa s）0.0005-0.01。差示扫描量热法使用Micro-Cal的差示扫描微量热计（VP-DSC）进行量热测量。 以60/ h的加热速率，10至50之间获得热像。 在每个实验中进行至少三次加热/冷却循环。 在使用丁卡因和利多卡因的实验中，用丙泊酚（HEPES + 0.5DMSO），用参考细胞填充HEPES。 使用软件Origin 7.0分析热分析图。 在减去参考扫描后，原始数据相对于有效磷浓度标准化。 焓计算不可能画出真实的基线，因为转换的开始时间低于10，这是我们的量热计可以访问的最低温度， 对每个系统进行了三次独立实验。31P NMR在11.746T，31P频率为3202.457MHz的磁场和BBO探针上操作的Bruker Avance II + 500MHz（UltraShield Plus Magnet）（Karlsruhe，Germany）获得31P NMR光谱。 所有化学位移值以百万分之一ppm（ppm）为参考磷酸85，正值与低场偏移相关。 通过门控宽带质子去耦获得所有光谱。 光谱宽度为80kHz（400ppm），脉冲间隔时间为2s， 射频脉冲（11.3ls）。 在傅立叶变换之前，将光谱提交到指数乘法，导致50Hz线宽展开，以提高信噪比。 每个实验的累积时间为40分钟。 在12,25,37和60获得所有光谱，以获得每种麻醉剂的最高浓度，而对于较低浓度，实验在37的固定温度下进行。结果和讨论使用QCM-D，DSC和31P NMR的脂质体模型POPC / SM和POPC / SM / CHOL获得的结果在以下部分中给出，将强调由于胆固醇的存在引起的差异。胆固醇在脂质体中的存在的影响典型的QCM-D实验包括以下步骤顺序：（1）金涂层石英晶体与脂质体悬浮液的接触; （2）用HEPES冲洗; （3）注射麻醉液; （4）最后冲洗。 频率归一化变化的值Df / n和耗散量DD记录到第9个泛音。通常，步骤1引起谐振频率的大偏移伴随着耗散的大的偏移。相比之下，用HEPES（步骤2）冲洗具有小的作用（对于POPC / SM脂质体稍大一点），这意味着大部分脂质体不可逆地吸附在表面上。在步骤1和2中获得的频率和耗散位移的值如表2所示，根据我们以前的研究（Serro等，2012），它们与存在单层变形但完整的，囊泡。高耗散值是典型的粘弹性薄膜，其不能与晶体振荡完全耦合并耗散能量。除37下的POPC / SM脂质体外，所有情况下的频移相似。没有胆固醇的脂质体刚度较低，因为它们的膜在这种温度下处于液体无序相（Pokorny等，2006）。结果，它们将在吸附时变平，以增加与金表面的接触点，导致较小的频移，这表明每单位面积吸附质量较低。从建模获得的平均粘弹性性质也列于表2中，但在某些情况下不能计算的剪切模量除外。筏状脂质体层比POPC / SM脂质体层厚，而两种组合物具有相似的粘度。当温度升高时，厚度增加，粘度略有下降。在这一点上，我们必须强调，电影特定参数的频率和耗散变化的量化需要先前的电影均匀性知识。 在最近的一项工作中，Reviakine等 （2011）质疑Voigt-Voinova模型对由离散纳米尺度物体构成的横向异质膜的有效性。 然而，对于高表面覆盖度，我们的情况（Serro et al。，2012），粘弹性模型是一种很好的方法。在DSC中获得的胆固醇的存在对POPC / SM / CHOL脂质体的热行为的影响如图1所示。显然，胆固醇的存在消除了凝胶对液晶相转变二进制POPC / SM，提交相同的热处理。事实上，二元混合物显示出从低于10开始的宽转变峰（这是我们设备中可接近的最低温度），结束于约40，最大值约为29.5。这个宽峰值与多相区域的存在一致（Pokorny等人，2006; Almeida等，2003）。根据以前的研究（Ausili et al。，2008），POPC是一种不饱和脂肪，主要转变温度为38，SM含量较大，饱和酰基较多，导致高凝胶 - 液晶转变温度在38。提出的相图表明，对于POPC / SM的等摩尔混合物，富含鞘磷脂的So（固体有序凝胶相）结构域和富含POPC的Ld结构域在室温下共存。当温度升高时，两相变成完全混溶的，产生单一的Ld相。许多作者（Ausili et al。，2008; Pokorny et al。，2006）也观察到胆固醇加入以形成POPC / SM / CHOL的等摩尔三元混合物时，这个宽峰的消失。 根据以前提出的三元相图（Pokorny等人，2006; Almeida等，2003），在22下，POPC / SM / CHOL的等摩尔混合物产生液体有序相，在富含胆固醇和SM中，与液体无序相共存，Ld，胆固醇差，富含POPC。 随着温度的升高，Ld的量稍微增加，但是从部分转变Lo 到 Ld释放出来的热显然太小，在DSC中不能检测到。通过这些观察，我们可以说，在二元混合物中，POPC不稳定鞘磷脂分子的酰基链顺序，并诱导富含SM和富含POPC的流体样结构域的刚性结构域的出现。 此外，胆固醇的存在引起液体有序相，归因于胆固醇分子与鞘磷脂酰基链的优先相互作用（Pokorny等人，2006; Quinn和Wolf，2009; Chemin等人，2008）。在12和60之间的四个温度下，具有筏状和二元POPC / SM组成的脂质体的31P NMR谱如图2所示。在12时，两个光谱都显示出高场峰和低场肩峰。 这种线形大约为50ppm，这是由于双层液体有序相，并且与SM和PC上的先前静态31P NMR结果一致（Holland等，2006）。 SM在凝胶相中呈现轴向对称分量和不对称组分，而PC产生轴对称的粉末图案，因为它高于Tm。 如前所述，固体有序凝胶相So与二元体系中的液体无序相Ld共存，而在三元混合物中，液体有序域Lo构成与残留液体无序相Ld。当温度升高时，观察到线状的显着变化。 在37下，二元体系与三元体系的比较清楚地表明胆固醇的存在阻止了脂质体壁的流化。 在较高的温度（60）下，二元脂质体的头部经历了几乎完全的各向同性运动，表明存在液体无序相。 对于筏状脂质体，线宽图1.HEPES中POPC / SM / CHOL脂质体（黑色）和POPC / SM脂质体（灰色）的热图。 图2.更广泛，表明由于胆固醇的稳定作用，少量液体排序的结构域可能保留（Aussenac等，2003）。 这种行为与两种组合物的DSC结果良好相关。丁卡因的影响图3表示在37下的典型QCM-D实验，描述了将25mM丁酰胺溶液加入到吸附的脂质体层中的过程。丁卡因以明显不同的方式影响两种类型的脂质体。 POPC / SM / CHOL脂质体遭受急剧的频率下降，随后所有泛音均稳定增加，消耗增加后减少，对于较高的泛音而言更为显着。在POPC / SM的情况下，频率值降低并且耗散值增加，但是频率和耗散随时间趋向于恒定的稳定值。这些结果表明丁卡因诱导POPC / SM / CHOL脂质体的快速溶胀，然后是较小脂质体的部分破裂，但较大的脂质体继续膨胀。膨胀假说通过粘弹性建模证实，这导致吸附层的厚度平均增加50nm，而部分断裂引起粘度波动，最终减少0.2mPas。相比之下，POPC / SM脂质体层的粘度永久增加约10nm，粘度增加0.3mPas，表明增加了脂质膜的包装（Fogel和Limson，2011）。图4显示了温度对丁卡因（25mM）与两种组合物的脂质体相互作用的影响，在25和37下，通过典型实验得到的归一化频移（第3次谐波） C。对于筏状脂质体，初始频率降低伴随着耗散增加，意味着吸附层膨胀。然而，这种趋势在某些时候是相反的，频率开始增加，而耗散大幅度增加。这种行为表明包裹在破裂的脂质体和/或间隙水内的水的释放，伴随着剩余的吸附脂质体的重新排列。水释放持续到冲洗步骤。漂洗后，在37下，实验所用的丁卡因引入前，频移实现的值远低于脂质体对应的值。这表明丁卡因诱导的吸附量变化是不可逆转的，正如脂质体的部分破裂所预期的那样。在25时，丁卡因的作用是准可逆的，并且在漂洗时，附着于脂质体的丁卡因可能被去除。对于二元组成，耗散随着频率的降低而线性增加，两种温度的丁卡因作用均接近可逆。斜率DD / Df较小，表明吸附的脂质体有轻微变化，特别是在37。当研究丁卡因浓度的影响（图5）时，第3次泛音的频率和耗散移动的平均结果清楚地表明丁卡因的作用是浓度依赖性的，并且主要修饰在25mM 筏状脂质体，具有相当大的消耗增加，表明脂质体肿胀。 在12.5mM时，筏式脂质体的溶胀度更为适度，二元混合物的轻度耗散减少，这表明形成更为刚性的吸附层。 这些观察结果进一步证明了丁卡因与筏状结构域在37下更强的相互作用。图6A和B分别显示了通过将丁卡因分别加入到三元和二元脂质混合物中而获得的热分析图。 向筏状脂质体中加入少量丁卡因（5mM）不会以显着的方式影响三元混合物的热行为。 然而，增加浓度，显然，宽的相变出现以浓度依赖性方式降低的最高温度（12.5mM为20.3，对于25mM为19.2）。 在转化峰的最大值之后，Cp的明显降低表明脂质溶解，其与已知的丁卡因表面活性剂性质良好相关，并与在支持脂质体的QCM-D中观察到的现象一致。对于二元混合物，增加丁卡因浓度导致主要转变温度的下降，表明膜的流化。 在转化峰的最大值之后，Cp的降低表明脂质体的部分溶解，这对于测试的最大浓度的丁卡因是特别重要的。 在二元支持的脂质体中没有观察到这种增溶作用，似乎更稳定。 一个有趣的结果是峰的半高处的宽度减小，即转移与麻醉剂浓度的协同性的增加。 协同增加的一个可能的解释是脂质链的更好的填充，正如QCM-D所提出的，由大的丁卡因吸收和Ld结构域的优先增溶引起的引起更均匀的混合物。上述结果与我们以前的研究结果相矛盾（Paiva et al。，2012）。 事实上，丁卡因与DMPC脂质体的相互作用导致其破坏和溶解。 相比之下，含有胆固醇的脂质体在麻醉剂存在下保持稳定。31P NMR光谱（图7A）显示，在三元体系中加入丁卡因（25mM）在较低温度（12和25）下产生各向异性的小的增加，而在37时，轻微的系统发生。这些观察结果与QCM-D和DSC结果表明的筏状脂质体的溶解似乎不一致。然而，如果在溶液中存在保持其结构的脂质体，则在NMR光谱中可能不检测到这种增溶。对于二元系统（图7B），在12下加入丁卡因导致各向同性峰的出现，这可能是由于与固相有序凝胶相的相互作用，即富含SM的相。在25效果更加激烈，在较高的温度（37和60）下，二元混合物大部分在液体无序相中，并且没有检测到丁卡因的作用。这与QCM-D结果（图4，底部）一致，这表明丁卡因在37下对二元组成的固体支持的脂质体的影响可以忽略不计。利多卡因的影响在图8中，比较利多卡因对POPC / SM / CHOL和POPC / SM脂质体的影响，在37和较高浓度（69mM）下，显示出在第3次谐波频移的降低。 观察到其他泛音的类似行为。 对于POPC / SM脂质体，存在脂质体溶胀的消散增加的证据，可通过22nm的厚度增加的粘弹性建模所证实。 对于筏式混合物，耗散的修改是可以忽略的，并且通过粘弹性建模没有获得溶胀，但粘度为0.3mPas和剪切模量为5kPa的增量表明利多卡因通过略微增加其刚度来影响膜的结构。在与利多卡因（69mM）相互作用时，两种脂质体组成的温度影响如图9所示。数据证实，在37下，POPC / SM脂质体发现最相关的变化（图8C），表明利多卡因干扰没有胆固醇的膜。 在这个温度下，二元体系主要处于液体无序相，利多卡因渗透到液晶相膜内，导致横向膨胀（Takeda等，2009）。图8提供的浓度效应为这一假设提供了进一步的证据，因为较低浓度的利多卡因（35mM）在37下不会引起筏状脂质体的任何变化，同时促进了二元混合脂质体小的频率降低和耗散增加，这可能是轻微肿胀的结果。在利多卡因存在下，POPC / SM / CHOL和POPC / SM脂质体的热力学行为如图10所示。向筏状脂质体中加入利多卡因（35mM）诱导出现广泛的相变，在实验的温度范围内没有可识别的起始点和终点。将利多卡因浓度提高到69mM，峰值面积似乎增加，转化峰的最大值降低，这表明对膜的扰动效应较高。这些结果表明，利多卡因分子与膜相互作用，有利于脂质体的排序，这与使用粘弹性建模获得的报告的刚度增加一致。 曲线的形状表明，加入利多卡因后不会发生脂质溶解。在没有胆固醇的情况下，利多卡因会将过渡峰值的最大值降至与筏中观察到的相似的温度值。尽管热分析图不允许评估与转变相关的焓，但利多卡因浓度（69mM）下获得的峰值下增加的面积表明与三元混合物观察到的相比，能量转换更为有效。此外，该峰的形状表明在较低温度下可能由利多卡因与固体有序凝胶相的相互作用引起的另一相转变的初期出现。其他作者发现利多卡因以高浓度与凝胶状态膜相互作用形成叉指结构（Takeda et al。，2009）。对于两个浓度Cp值在峰值后变为负值，与QCM-D结果相反，还存在一些支持二元混合物部分脂质溶解的证据。事实上，未检测到固体支持的POPC / SM脂质体的溶解，这可能归因于与溶液中的这些脂质体相比较，这些脂质体的耐药性更高（Paiva等，2012）。图11显示了将利多卡因（浓度为69mM）加入到这两种类型的脂质体中时获得的31P NMR光谱。根据QCM-D和DSC中获得的结果，在臀状脂质体中出现肩部，其与麻醉剂的排序效应相似，可能增加Lo相。在37，各向异性的降低通过流化液体有序的结构域来证明利多卡因与筏状混合物的相互作用。对于二元混合物，在磷脂的极性头基运动中诱导的修饰是可忽略的。这些结果似乎与DSC和QCM-D测定结果不一致，指出利多卡因与POPC / SM脂质体的相互作用较强。然而，如果利多卡因与两种脂质膜的相互作用发生在不同深度，则可以解释这个明显的矛盾。由于31P NMR技术仅对极性头组运动敏感，我们可以得出结论，利多卡因与溶剂界面处的筏式脂质体相互作用。相比之下，用二元混合物获得的结果表明麻醉剂与脂质膜的疏水核心相互作用。异丙酚的影响如前所述，异丙酚在HEPES中的溶解是通过加入0.5（v / v）的DMSO来实现的。研究了由DMSO引起的脂质壁的最终扰动。与之前使用基于DMPC的脂质体的工作（Paiva等，2012）相反，使用QCM-D技术没有发现任何作用。图12表示异丙酚（1mM）与POPC / SM / CHOL和POPC / SM脂质体在25和37下相互作用的频移（第3次泛音）的耗散。在生理温度下，两种类型的脂质体都显示出一个小的斜率，而建模的结果并没有表明厚度和粘度有任何变化。在25时，略有膨胀，对于筏状脂质体而言更为重要，与POPC / SM的9nm相比，模拟的厚度增加14nm。对于二元混合物，异丙酚的影响的温度依赖性与其他作者的发现（Bahri等，2005）一致，他们声称异丙酚不会将脂质膜的微粘度改变到相变温度以上，在此温度以下，引起微粘度降低。没有明显的变化是由冲洗造成的，这表明这种相互作用是不可逆转的。筏样混合物的热力学行为显然不受DMSO的存在影响。 然而，二元混合物的主要转变温度降低（4），表明DMSO在一定程度上诱导脂质结构域的流化。 全身麻醉剂，丙泊酚在两种混合物中的作用如图13所示。丙泊酚对筏状脂质体的相行为的影响是可忽略的，但在二元混合物中，它也导致主转变温度的降低使脂质的轻微溶解。与脂质体在HEPES或HEPES + DMSO中获得的31P NMR光谱（未显示）的比较没有显示出与QCM-D结果一致的独立于脂质组成的DMSO的任何影响，但与DSC的相反。 以1mM的浓度添加异丙酚不会导致在所有温度下筏状和二元混合物脂质体的光谱线形状的任何显着修饰。总体而言，所有数据表明丙泊酚与POPC / SM / CHOL和POPC / SM脂质体的相互作用不会引起形成脂质体的脂质的结构或头部运动的有意义的变化。 在中性pH丙泊酚具有高浓度的带电分子的事实可以部分地解释其与猕猴桃脂质的弱相互作用（Tsuchiya和Mizogami，2008; Tsuchiya等，2010a，2011）。与其他脂质膜组成比较在这一点上，应该与以前的工作（Paiva et al。，2012）的结果进行比较，涉及到相同的麻醉剂和其他真核细胞模型。 所有麻醉剂导致DMPC，DMPC / CHOL和DPPC / DMPC / CHOL脂质体模型膜的流化，但与目前的QCM-D结果相反，与麻醉分子的相互作用并未引起吸附脂质体的任何溶胀 但只释放间隙或核心水。 重要的是要强调，我们以前的QCM-D实验是在25进行的，因此这些结果的比较仅在该温度下进行。 用丁卡因和丙泊酚观察到最明显的差异。高浓度（25mM）的丁卡因引起DMPC脂质体的大量扰动，无论是负载还是在溶液中，导致其溶解。然而，向DMPC添加胆固醇改善了膜对丁卡因作用的稳定性和完整性。相比之下，筏状脂质体中胆固醇的存在不是丁卡因作用的障碍，甚至增强与这种麻醉剂的相互作用。这些差异的可能解释来自于这些脂质体系的相行为的分析。在25时DMPC高于其转变温度，而DMPC / CHOL处于凝胶相。在相同温度下，在二元混合物POPC / SM中，凝胶相So与液体无序相Ld共存，而在三元混合物中，富含胆固醇和SM的液体有序相Lo与较小液体无序相共存，Ld，胆固醇含量少，POPC含量丰富。这意味着添加胆固醇对DMPC具有冷凝作用，并且通过其与So相的相互作用对POPC / SM产生混乱影响，富含SM，这有助于与丁卡因的相互作用。尽管使用的浓度远低于用于局部麻醉剂的浓度，但全身麻醉剂异丙酚引起DMPC和DMPC / CHOL脂质体中的大扰动。 相比之下，丙泊酚的浓度比以前使用DMPC和DMPC / CHOL大4倍，在POPC / SM和筏状脂质体中产生了更小的扰动。总的来说，我们可以得出结论，根据脂质体的脂质组成和麻醉剂的类型，胆固醇的存在可能对麻醉作用产生不同的后果。结论本研究的一般结论是丁卡因，利多卡因和丙泊酚与筏状和非筏状脂质体以不同的方式相互作用。在生理温度下，丁卡因似乎与筏状结构域相互作用较大，而利多卡因对没有胆固醇的膜有较大的影响。丙泊酚的结果不清楚：QCM-D不表示出任何与筏状或二元混合脂质体的相互作用，而热分析图表明POPC / SM脂质体的轻微流化和溶解。在生理温度下，丁卡因（25mM）诱导筏样脂质体溶解，固体和悬浮状都溶解都溶解。丁卡因在这些脂质体中的另一个显着效果是以12.5mM和25mM的浓度诱导相变。还有证据表明，在这一温度下，丁卡因可以诱导二元筏状脂质体膜的流化。然而，由于二元系统已经处于液体无序的阶段，所以麻醉剂的作用不那么明显。利多卡因对脂质流化作用的影响并不十分强烈，但对两种类型的脂质体的影响都有显著差异。在生理温度下，利多卡因似乎与POPC / SM脂质体的膜芯相互作用导致其膨胀，而在筏状脂质体中，相互作用较弱，并且优先在与溶剂的界面处发生。仅在二元体系脂质体中发现脂质体在溶液中的部分溶解。丙泊酚在生理温度下对两种组合物的脂质体影响很小，因为其浓度比局部麻醉剂使用的最低值小一个数量级，因此不能与其他两种麻醉药直接比较。此外，各种技术的结果不一致，可能是由于观察到的影响程度很小。 然而，在25时，丙泊酚对筏状脂质体具有肿胀作用。 可以得出结论，在生理温度下，如果仅使用本技术，则不能通过与本研究中研究的脂质膜模型的相互作用来解释丙泊酚的作用机制。与以前使用DMPC和DMPC / CHOL脂质体作为模型膜的工作结果的比较显示，尽管麻醉剂导致所有模型膜（除了丙泊酚在筏状脂质体上除外）的流化，但是吸附的脂质体上的溶胀作用只能是 在POPC / SM或在筏类脂质体（POPC / SM / CHOL）中观察到在本工作中研究。 主要区别在于在25下用丁卡因获得的QCM-D结果。虽然含胆固醇的DMPC脂质体比纯DMPC脂质体更能抵抗这种麻醉剂的作用，但筏样脂质体比不含胆固醇的二元混合物（POPC / SM）形成的脂质体更受影响。致谢作者感谢基金会（FCT）通过项目PEst-OE / QUI / UI0100 / 2011财务支持这项研究。参考文献Almeida, R.F.M., Fedorov, A., Prieto, M., 2003. Sphingomyelin/phosphatidylcholine/cholesterol phase diagram: boundaries and composition of lipid rafts. Biophys.J. 85, 24062416.Almeida, R.F.M., Loura, L.M.S., Prieto, M., 2009. Membrane lipid domains and rafts:current applications of fluorescence lifetime spectroscopy and imaging. Chem.Phys. Lipids 157, 6177.Ausili, A., Torrecillas, A., Aranda, F.J., Mollinedo, F., Gajate, C., Corbalan-Garcia, S., deGodos, A., Gomez-Fernandez, J.C., 2008. Edelfosine is incorporated into rafts andalters their organization. J. Phys. Chem. B 112, 1164311654.Aussenac, F., Tavares, M., Dufourc, E.J., 2003. Cholesterol dynamics in membranes ofraft composition: a molecular point of view from 2H and 31P solid-state NMR.Biochemistry US 42, 13831390.Avanti Polar Lipids Determination of Total Phosphorus. (cited25.07.12).Bahri, M.A., Heyne, B.J., Hans, P., Seret, A.E., Mouithys-Mickalad, A.A., Hoebeke, M.,2005. Quantification of lipid bilayer effective microviscosity and fluidity effectinduced by propofol. Biophys. Chem. 114, 5361.Bahri, M.A., Seret, A., Hans, P., Piette, J., Deby-Dupont, G., Hoebeke, M., 2007. Doespropofol alter membrane fluidity at clinically relevant concentrations? An ESRspin label study. Biophys. Chem. 129, 8291.Boren, E., Teuber, S.S., Naguwa, S.M., Gershwin, M.E., 2007. A critical review of localanesthetic sensitivity. Clin. Rev. Allerg. Immunol. 32, 119128.Chemin, C., Bourgaux, C., Pean, J.-M., Pabst, G., Wuethrich, P., Couvreur, P., Ollivon,M., 2008. Consequences of ions and pH on the supramolecular organization ofsphingomyelin and sphingomyelin/cholesterol bilayers. Chem. Phys. Lipids 153,119129.Edidin, M., 2003. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev.Bioph. Biom. 32, 257283.Falck, E., Hautala, J.T., Karttunen, M., Kinnunen, P.K.J., Patra, M., Saaren-Seppala, H.,Vattulainen, I., Wiedmer, S.K., Holopainen, J.M., 2006. Interaction of fusidic acidwith lipid membranes: implications to the mechanism of antibiotic activity.Biophys. J. 91, 17871799.Fogel, R., Limson, J.L., 2011. Probing fundamental film parameters of immobilizedenzymes Towards enhanced biosensor performance. Part I QCM-D mass andrheological measurements. Enzyme Microb. Technol. 49, 146152.Frangopol, P., Mihailescu, D., 2001. Interactions of some local anesthetics andalcohols with membranes. Colloids Surf. B 22, 322.Giocondi, M.C., Boichot, S., Plenat, T., Le Grimellec, C., 2004. Structural diversity ofsphingomyelin microdomains. Ultramicroscopy 100, 135143.Hanzal-Bayer, M.F., Hancock, J.F., 2007. Lipid rafts and membrane traffic. FEBS Lett.581, 20982104.Heerklotz, H., 2002. Triton promotes domain formation in lipid raft mixtures.Biophys. J. 83, 26932701.Holland, G.P., McIntyre, S.K., Alam, T.M., 2006. Distinguishing Individual lipidheadgroup mobility and phase transitions in raft-forming lipid mixtures with31P MAS NMR. Biophys. J. 90, 42484260.Keller, C., Kasemo, B., 1998. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorptionmeasured with a quartz crystal microbalance. Biophys J. 75, 13971402.London, E., 2005. How principles of domain formation in model membranes mayexplain ambiguities concerning lipid raft formation in cells. Biochim. Biophys.Acta 1746, 203220.Manders, E.M.M., Verbeek, F.J., Aten, J.A., 1993. Measurement of co-localization ofobjects in dual-colour confocal images. J. Microsc. Oxford 169, 375382.McIntosh, T.J., 2007. Overview of membrane rafts. In: McIntosh, T.J. (Ed.), LipidRafts, Methods in Molecular Biology Series, vol. 398. Humana Press Inc., Totowa,NJ, pp. 17.McMullen, T., Lewis, R., McElhany, R., 2004. Cholesterolphospholipid interactions,the liquid-ordered phase and lipid rafts in model and biological membranes.Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 8, 459468.Onuki, Y., Takayama, K., 2010. Phase behavior in a ternary lipid membraneestimated using a nonlinear response surface method and Kohonens selforganizingmap. J. Colloid Interface Sci. 343, 628633.Paiva, J.G., Paradizo, P., Serro, A.P., Fernandes, A., Saramago, B., 2012. Interaction oflocal and general anaesthetics with liposomal membrane models: a QCM-D andDSC study. Colloids Surf. B. 95, 6574.Patra, S., 2008. Dissecting lipid raft facilitated cell signaling pathways in cancer.Biochim. Biophys. Acta 1785, 182206.Pissinis, D., Sereno, L.E., Marioli, J.M., 2005. Multi-wavelength spectrophotometricdetermination of propofol acidity constant in different acetonitrilewatermixtures. J. Braz. Chem. Soc. 16, 10541060.Pokorny, A., Yandek, L.E., Elegbede, A.I., Hinderliter, A., Almeida, P.F.F., 2006.Temperature and composition dependence of the interaction of d-Lysin withternary mixtures of sphingomyelin/cholesterol/POPC. Biophys. J. 91, 21842197.Quinn, P.J., Wolf, C., 2009. Thermotropic and structural evaluation of the interaction ofnatural sphingomyelins with cholesterol. BBA-Biomembranes 1788