NRP与舌癌.doc

3中文摘要目的检测Neuropilin-1(NRP-1)及其配体Semaphorin 3A(SEMA 3A)在舌鳞状细胞癌组织和舌鳞状细胞癌SCC9细胞株中的表达情况及外源性SEMA3A蛋白对舌鳞状细胞癌SCC9细胞株的影响。方法（1）应用免疫组织化学方法检测NRP-1、SEMA 3A在舌鳞状细胞癌组织和正常舌体组织中的表达并随访舌鳞状细胞癌患者生存率。采用SPSS17.0软件进行统计学分析。（2）应用免疫细胞化学方法检测NRP-1、SEMA 3A在SCC9细胞系中的表达。（3）应用Western blot和RT-PCR方法检测NRP-1、SEMA3A在舌鳞状细胞癌组织、舌鳞状细胞癌细胞系SCC9及正常舌体组织中的表达。（4）应用MTT实验检测外源性SEMA3A蛋白对SCC9细胞增殖的影响。（5）应用Transwell实验检测外源性SEMA 3A蛋白对SCC9细胞迁移、侵袭的影响。结果（1）免疫组织化学显示，8/42例舌癌组织中SEMA 3A呈强阳性表达，16/42例舌癌组织中SEMA 3A呈阳性表达，18/42例舌癌组织中SEMA 3A呈阴性表达；8/15例正常舌组织中SEMA 3A呈强阳性表达，5/15例正常舌组织中SEMA3A呈阳性表达，2/15例正常舌组织中SEMA3A呈阴性表达。13/42例舌癌组织中NRP-1呈强阳性表达，24/42例舌癌组织中NRP-1呈阳性表达，5/42例舌癌组织中NRP-1呈阴性表达；0/15例正常舌组织中NRP-1呈强阳性表达，3/15例正常舌组织中NRP-1呈阳性表达，12/15例正常舌组织中NRP-1呈阴性表达。SEMA 3A、NRP-1在舌癌及正常舌体组织中的表达有显著南京医科大学硕士专业学位论文4性差异(P0.05）；随访全组患者的1、3年生存率分别为76.2%、57.1%，SEMA 3A阳性组的1、3年生存率分别为83.3%、62.5%，SEMA 3A阴性组的1、3年生存率分别为66.7%、50.0%，两组间未见统计学差异。SEMA 3A强阳性组8人中仅1人于1年内死亡，余7人生存超过3年，1、3年生存率均为87.5%，均高于SEMA3A阴性组，但无统计学差异。NRP-1阳性组的1、3年生存率分别为75.7%、54.0%，NRP-1阴性组的1、3年生存率分别为80.0%、80.0%，两组间未见统计学差异。在logistic回归分析中，年龄对1年生存率的影响及淋巴结有无转移对3年生存率的影响有统计学意义。（2）免疫细胞化学显示，SEMA 3A在舌鳞状细胞癌SCC9细胞株中阴性表达，NRP-1在舌鳞状细胞癌SCC9细胞株中阳性表达。（3）Western blot和RT-PCR显示SEMA 3A在舌鳞状细胞癌细胞及组织中阴性表达，正常舌体中阳性表达；NRP-1在舌鳞状细胞癌细胞及组织中阳性表达，正常舌体中阴性表达。（4）1000pM外源性SEMA3A蛋白明显抑制舌鳞状细胞癌SCC9细胞株的增殖(P0.05)。结论（1）SEMA3A在舌鳞状细胞癌组织及细胞中表达降低，NRP-1在舌鳞状细胞癌组织及细胞中表达增高，提示肿瘤的发生发展可能与其表达异常有关。（2）外源性SEMA3A蛋白可以抑制SCC9细胞株的增殖，可能为舌鳞状细胞癌基因靶点治疗提供新思路。关键词SEMA 3A；NRP-1；舌鳞状细胞癌；SCC9南京医科大学硕士专业学位论文5AbstractObjectiveTo investigate the expression of NRP-1 and its ligand SEMA 3A in the humantongue squamous cell carcinoma tissues and cell line SCC9.The effect of exogenousSEMA 3A protein on SCC9 was observed.Methods(1)Immunohistochemical staining was used to survey the expression of NRP-1and SEMA 3A between human carcinoma of tongue specimens and non-malignant tongue tissues,and follow-up the survival rate.The data wereanalyzed with SPSS 17.0 software package.(2)Immunocytochemistry was used to survey the expression of NRP-1,SEMA3A in cell line SCC9.(3)Western blot and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)were used to survey the expression of NRP-1,SEMA 3A in humancarcinoma of tongue specimens,cell line SCC9 and non-malignant tonguetissues.(4)MTT assay was used to study the effect of exogenous SEMA 3A on theproliferation of SCC9.(5)Transwell assay was used to investigate the effect of exogenous SEMA 3Aon the migration and invasion of SCC9.Results(1)Immunohistochemical staining showed SEMA 3A was strongly positive in8/42 human carcinoma of tongue specimens and positive in 16/42 humancarcinoma of tongue specimens while negative in 18/42 human carcinomaof tongue specimens;SEMA 3A was strongly positive in 8/15 non-maligna-nt tongue tissues and positive in 5/15 non-malignant tongue tissues whilenegative in 2/15 non-malignant tongue tissues.NRP-1 was stronglypositive in 13/42 human carcinoma of tongue specimens and positive in24/42 human carcinoma of tongue specimens while negative in 5/42 human南京医科大学硕士专业学位论文6carcinoma of tongue specimens;NRP-1 was positive in 3/15 non-malignanttongue tissues.There was significant difference between human carcinomaof tongue specimens and non-malignant tongue tissues(P0.05）;The overall survival rates of 1,3years were respectively 76.2%and 57.1%in the whole group,in SEMA 3Apositive groups they were respectively 83.3%,62.5%and in SEMA 3Anegative groups they were 66.7%,50.0%,there was no significantdifference in survival rates between the two groups，and in SEMA 3Astrongly positive groups they were respectively 87.5%（7/8），higher thannegative group but no significant difference;in NRP-1 positive group theywere respectively 75.7%,54.0%and in negative group they were 80.0%,80.0%,there was also no significant difference between the two groups.There was relation between age and 1-year survival rate.Whether or notlymph node metastases has something to do with 3-year survival rate.(2)Immunocytochemistry showed the expression of SEMA 3A was negative incell line SCC9 and the expression of NRP-1 was positive in cell line SCC9.(3)Western bloting and RT-PCR indicated the negative expression of SEMA3A and positive expression of NRP-1 in the human tongue squamouscarcinoma tissues and cell line SCC9.(4)The proliferation of SCC9 was inhibited by 1000pM exogenous SEMA 3A(P0.05).Conclusion(1)The negative expression of SEMA 3A and enhanced expression of NRP-1in human carcinoma of tongue specimens and cell line SCC9 indicated thatthe progression of tumor may have something to do with their abnormalexpression.南京医科大学硕士专业学位论文7(2)Exogenous SEMA 3A could inhibite the proliferation of SCC9 indicatedthat it may provide a new way for tumor gene-targeted therapy.Key wordsSEMA 3A；NRP-1；Squamous cell carcinoma of tongue;SCC9南京医科大学硕士专业学位论文8缩略词表缩略词英文全称中文对照EMTepithelial-mesenchymaltransition上皮间质转变NRP neuropilin神经菌毛素PSI plexin-semaphorin-integrin plexin与semaphorin整合SCC squamous cell carcinoma鳞状细胞癌SEMA semaphorin信号素VEGFvascular endothelial growthfactor血管内皮生长因子VEGFRvascular endothelial growthfactor receptor血管内皮生长因子受体南京医科大学硕士专业学位论文9前言肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，随着研究的深入，逐渐发现许多的生物因子与肿瘤发生、增殖、侵袭及血管生成等有关。1993年Kolodkin1等学者首次在蝗虫胚胎神经生长锥中发现Semaphorins分子，Semaphorins为一大类分泌型和膜结合分子，对神经系统的发育及轴突导向具有非常重要的意义。近年来研究发现，Semaphorins分子在各种生物中均有表达，根据结构及氨基酸序列的同源性对其分类，主要可分为8个亚类，其中第1、2亚类存在于无脊椎动物中，第3至7亚类分布于脊椎动物中，第8亚类则由病毒编码2。Semaphorins分子功能区主要是其氨基端的500个氨基酸区域（sema）3。脊椎动物中最先被确认的是SEMA 3亚类，且SEMA 3亚类是最典型的Semaphorins分子，1993年Luo4等学者自鸡脑提取液中发现SEMA3亚类，且研究提示其可导致神经元轴突塌陷并排斥轴突伸展。至今为止，SEMA3A是研究较为充分的semaphorins分子之一，且SEMA3是脊椎动物中唯一的分泌型semaphorins。Semaphorins高亲和的受体包括Plexins和Neuropilins(NRPs)。NRPs仅在脊椎动物表达，是单个跨膜糖蛋白，早期被确认为SEMA 3及血管内皮生长因子(VEGF)的共受体。脊椎动物的膜结合Semaphorins可以直接结合plexins,而分泌性的semaphorins(指第3家族)也需要借助NRPs起作用，SEMA3E除外5。神经菌毛素(Neuropilins，NRPs)是一种跨膜糖蛋白，包括NRP-1以及NRP-2，起初基于它们在神经系统发育中的重要作用而被发现5。NRP-1基因敲除小鼠的神经发育不良并且四肢也不能受到神经正确的支配6。NRP-2基因敲除小鼠的神经发育缺陷，成年脑中的纤维束发育不良或者缺失7。近年来研究发现SEMA3A及受体NRP-1除调控神经系统发育外，还可调控细胞粘附、迁移及血管发生，从而影响肿瘤的发生发展8-14。有研究表明SEMA3A在胰腺癌8，乳腺癌9，前列腺癌10中异常表达，Muller8等学者发现SEMA3A可作为胰腺癌预后的判定指标，表达上调可能与转移有关。Pan9等学者发现外源性100ng/ml浓度的人重组SEMA 3A可以明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-南京医科大学硕士专业学位论文10231的粘附、迁移和侵袭。有资料显示Neuropilins在肿瘤的脉管系统中表达，推测Neuropilins在血管发生和肿瘤生长中可能起调节作用并在多种肿瘤中表达上调,与肿瘤进展和/或不良预后有关。如在人类肿瘤中，NRP-1的表达与下列肿瘤生长和侵袭有关，见于：前列腺癌11，结直肠癌12，肺癌13，乳腺癌14等。Latil11等学者发现NRP-1在转移的前列腺癌中较原位癌高表达并推测可能与前列腺癌的转移有关，Parikh12等学者发现NRP-1在结直肠癌中的表达调控着血管的发生。这些都提示SEMA3A及配体NRP-1在肿瘤的发生发展中可能起到重要的作用。Semaphorin信号通路较为复杂，调控细胞的生存，增殖，凋亡的作用机制未明确。Narazaki15等学者认为可能和VEGF165与SEMA 3A竞争性地结合细胞膜上的NRP-1从而发挥不同的生物学作用有关。Herman16等学者认为可能和SEMA 3A在转录水平调控E-cadherin和整合素的表达，从而影响上皮间质转变（EMT）有关。目前，NRP-1及配体SEMA3A在头颈癌中的作用尚无报道，本课题组张红闯等17以Tca8113细胞系、舌鳞状细胞癌（以下称舌癌）患者临床组织标本为实验对象，发现舌鳞状细胞癌及正常舌组织中的NRP-1、SEMA3A表达存在差异。本实验继续以国际认可且为舌鳞状细胞癌研究中应用较普遍的舌鳞状细胞癌SCC9细胞株作为实验用细胞系，结合临床随访资料，探讨NRP-1及配体SEMA3A表达与舌鳞状细胞癌患者生存情况的相关性。此外通过检测外源性SEMA3A蛋白对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，初步探讨NRP-1及配体SEMA3A对舌鳞状细胞癌发生发展的影响及其可能机制。南京医科大学硕士专业学位论文11正文Neuropilin-1及其配体Semaphorin 3A在舌鳞状细胞癌中的表达及作用舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，危害人类健康，其发病机制尚未明确，成为研究的热点。本实验将从多个水平研究舌鳞癌细胞、舌癌组织中SEMA 3A及NRP-1的表达与正常舌组织比较，随诊其表达水平与生存状况相关关系，并通过外源性SEMA 3A蛋白作用于舌癌细胞株SCC9，检测对其增殖、迁移、侵袭的影响，以推测SEMA 3A及NRP-1的表达在舌癌中的分子机制及其临床意义。材料与方法1主要设备及试剂1.1主要实验仪器和器材(1)细胞恒温孵箱Hera公司(2)无菌超净工作台Banker公司(3)PTC-200 PCR仪MJ Research公司(4)mini型垂直板型电泳装置Bio-Rad公司(5)OLYMPUS光学显微镜及成像系统Olympus公司1.2材料1.2.1细胞株及组织标本来源口腔舌鳞状细胞癌细胞株（SCC9）购自美国ATCC。标本入选标准：（1）经临床病理确诊为舌鳞状细胞癌；（2）术前未经任何放化疗及生物治疗；（3）有完整的随访资料，随访至少3年以上。排除标准：（1）转移癌或多原发癌；（2）非因原发舌癌而引起死亡。根据癌细胞分化程度分为I级、级、级，即高、中、低分化。根据口腔癌的TNM分类分期（UICC2002）的标准分为I期、期、期、期。根据上述标准，从2000年1月至2006年11月在南京医科大学附南京医科大学硕士专业学位论文12属口腔医院就治的舌癌患者手术石蜡块中抽取42例，患者中男24例，女18例；年龄26-74岁，中位年龄54岁；病理分级为I级21例，级21例；临床分期为I期24例，期18例；无淋巴结转移者29例，有淋巴结转移者13例。15例正常舌组织来自南京医科大学附属口腔医院2009年6月-2009年10月舌癌患者的临床标本，所有病例病理诊断为舌鳞状细胞癌，术前未经过任何抗肿瘤治疗，标本取材于距肿瘤边缘至少2cm且术中病理证实切缘为阴性的舌体组织。1.2.2引物（Invitrogen公司设计合成）SEMA 3A(468bp)正义链：5TGAGTGATGTGAGAAGGGTG 3反义链：5GTTGTTGCTGCTTAGTGGAA 3NRP-1(464bp)正义链：5GGCTCCAAATAGACCTGGGG 3反义链：5GGTGCTGTCTATGACCGTGG 3-actin(265bp)正义链：5CTCCATCCTGGCCTCGCTGT 3反义链：5GCTGTCACCTTCACCGTTCC 31.3主要试剂及试剂的制备1.3.1主要试剂DMEM F12培养基(GIBCO公司，美国)，0.25%胰蛋白酶(GIBCO公司，美国)，胎牛血清(GIBCO公司，美国)，RNA提取试剂Trizol(Takara公司，大连)，PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKara公司，大连)，Premix Ex TaqVersion 2.0(TaKara公司，大连)，兔抗SEMA 3A(Abcam公司，英国),兔抗NRP-1(Abcam公司，英国)，兔抗-actin(博士德公司，武汉），SABC即用型染色试剂盒（博士德公司，武汉），四甲基偶唑氮（MTT，Sigma公司，美国），二甲基亚砜（DMSO，广州化学试剂厂，广州），外源性SEMA3A蛋白（Millpore公司，美国），Matrigel胶（GIBCO公司，美国），蛋白质RIPA裂解液(Roche公司，美国)，枸橼酸钠缓冲液(Boster公司，武汉)。1.3.2主要试剂的配制(1)0.01M PBS缓冲液：将NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO412H2O 2.88g、KH2PO4 0.2g南京医科大学硕士专业学位论文13加入烧杯，用蒸馏水定容成1L，调整PH值至7.27.4；(2)0.25%胰酶消化液：0.25g胰酶溶于100ml PBS缓冲液；(3)0.01M枸橼酸钠缓冲液；(4)0.1%DEPC水：1ml DEPC水溶于1000ml三蒸水，高压消毒，4保存；(5)10TAE制备：48.4g Tris碱、11.42ml冰乙酸、20ml 0.5mol/l EDTA(PH=8.0)，以0.1%DEPC水定容至1L；(6)DMEM F12培养基：将1L干粉DMEM F12溶于1000ml蒸馏水中，加入2.0gNaHCO3，用1M的HCl调PH值至7.1-7.2，加入青霉素、链霉素（双抗），0.22m滤膜过滤消毒，4保存；(7)0.02mol/L PBST缓冲液：Na2HPO412H2O 7g，NaH2PO42H2O 0.7g，NaCl 9g，用900ml纯水溶解后，加入Tween-20 0.5ml，调pH至7.4，纯水定容至1000ml，室温保存。2实验方法2.1细胞培养SCC9培养于DMEMF12完全培养液内（含10%胎牛血清、100g/ml青霉素和100g/ml链霉素，pH7.2），置于37、体积分数为5CO2饱和湿度孵育箱（Hera公司，荷兰）中培养。2.2免疫组织化学检测SEMA 3A、NRP-1的表达(1)切片常规脱蜡至水。(2)灭活：3%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。(3)热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0），电磁炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复煮沸2次。冷却至室温后PBS（pH7.2-7.6）洗涤2次。(4)封闭：滴加5%BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。(5)加一抗：一抗1：200稀释后滴加，37孵育1小时。PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟3次。南京医科大学硕士专业学位论文14(6)加二抗：滴加生物素化鼠抗兔IgG二抗于20-37孵育20分钟。PBS洗2分钟3次。(7)滴加试剂SABC，20-37 20分钟。PBS洗5分钟4次。(8)DAB显色：取1ml蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5分钟左右。(9)苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。(10)镜下观察拍照，结果判定：镜下观察以细胞中出现清晰棕黄色颗粒判定为阳性细胞，对于每例组织切片，高倍镜下随机选取10个视野，按细胞显色有无及深浅对染色强度进行评分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；积分1分为免疫反应阳性,积分2分为免疫反应强阳性。(11)随访截止到2009年11月，生存期从手术日期算起。(12)统计学处理：采用SPSS17.0软件包对SEMA 3A、NRP-1在舌癌及正常舌体组织中的阳性表达率差异分别进行进行2检验，生存率比较采用Kaplan-Meier法检验，组间比较采用logrank检验，多因素分析采用logistic回归，以P0.05为差异具有统计学意义。2.3免疫细胞化学检测SEMA 3A、NRP-1的表达(1)将密度为2106/L的SCC9细胞接种于24孔板，37、5%CO2条件下孵育24h；(2)SCC9细胞以0.01M冷PBS轻轻洗涤3次，每次35min，冷风吹干后，用4%多聚甲醛室温下固定20min；(3)0.01M冷PBS轻轻洗涤3次，每次35min，3%H2O2室温下作用30min，去除内源性过氧化物酶；(4)0.01M冷PBS轻轻洗涤3次，每次35min，0.1%Triton-X100室温下作用30min；(5)0.01M冷PBS轻轻洗涤3次，每次35min，10%山羊血清封闭20min，吸去多余液体，以PBS按1：200稀释一抗，加入一抗后放入湿盒中4过夜；(6)0.01M冷PBS轻轻洗涤3次，每次35min，分别加入二抗&三抗各15min；南京医科大学硕士专业学位论文15(7)0.01M冷PBS轻轻洗涤3次，每次35min，DAB显色510min，PBS漂洗；(8)镜下观察拍照，结果判定：镜下观察以肿瘤细胞中出现清晰棕黄色颗粒判定为阳性细胞，对于每例样本,高倍镜下随机选取10个视野，进行阳性细胞占同类细胞数的百分比计数，60%为强阳性表达。2.4 Western-bloting检测SEMA 3A、NRP-1的表达(1)蛋白提取取材组织：将所取标本组织冲洗干净，各取米粒大小组织块(称重约100mg)，剪碎后加入RIPA蛋白裂解液400l，匀浆机彻底匀浆。细胞：培养至细胞密度约80%时，用预冷PBS洗涤2次，加入RIPA蛋白裂解液400l，以细胞刮子刮取。转移至离心管，12000转/分离心10分钟。取上清，部分留置以测蛋白含量，其余按4:1体积加入5蛋白上样缓冲液，煮沸5分钟，EP管分装，-20保存。(2)测定蛋白含量制作标准曲线：从-20取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。按下表在各管中加入各种试剂。混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析，检测样品蛋白含量。0g 2.0g 4.0g 6.0g 8.0g 10.0g1mg/ml BSA2.0l 4.0l 6.0l 8.0l 10.0l0.15mol/L NaCl 20l 18.0l 16.0l 14.0l 12.0l 10.0lG250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml(3)上样和电泳：配制聚丙烯酰胺分离凝胶和聚丙烯酰胺浓缩胶。分离胶：ddH2O 2.0ml浓缩胶：ddH2O 1.83ml30%Acr-Bis 1.65ml 30%Acr-Bis 390l1.5MTris-HCl 1.25ml 1MTris-HCl 187.5l南京医科大学硕士专业学位论文1610%SDS 50l 10%SDS 15l10%AP 20l 10%AP 10lTEMED 4l TEMED 6l将分离胶均匀的注入玻璃板间，加入高度的2/3后，以无水酒精压平液面；待分离胶凝固后倒去无水酒精，用吸水纸吸干，加入浓缩胶，立即插入梳子；将玻板放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，每个泳道内加入样本15l，蛋白Marker加8l。浓缩胶85V恒压，分离胶110V恒压电泳；(4)转膜：取出电泳胶前，将海绵和滤纸放于转膜缓冲液中浸泡10min；切胶、铺胶于滤纸上，将浸润的NC膜覆盖在胶上，赶去之间存在的气泡，夹好，放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，冰浴下300mA恒流转膜2.5h；(5)封闭：取出NC膜，正面朝上，室温下以PBST漂洗3次10min，以去除NC膜上的SDS。将NC膜放入2.5g/50ml配制的脱脂奶粉中摇床振动，室温下封闭2h；(6)抗体杂交：PBST漂洗NC膜3次10min，以封口膜袋装NC膜，加入一抗1.5ml(1:1000)封闭，4孵育过夜。PBST漂洗NC膜3次10min，以封口膜袋装NC膜，加入二抗1.5ml(1:2000)37孵育1h后，PBST缓冲液漂洗NC膜10次10min；(7)检测：加入化学发光剂A：B=1：1。暗盒封闭，暗室曝光，显影、定影、水洗，晾干。2.5 RT-PCR检测SEMA 3A、NRP-1的表达(1)取材组织：将所取标本组织冲洗干净，各取米粒大小组织块，匀浆机匀浆。细胞：培养至待细胞接近融合时，用预冷PBS洗涤3次。(2)按Takara公司Trizol试剂盒操作方法一次抽提总RNA加入1mltrizol，室温放置5min，混合均匀；加入0.2ml氯仿，混合均匀，室温放置2min；放置入高速冰冻离心机，4，12000g15min，取上清；南京医科大学硕士专业学位论文17加入0.5ml异丙醇，混合均匀，室温放置10min；4，12000g10min，弃上清；75%乙醇1ml，洗涤，75005min，弃上清；晾干，加入55-65DEPC水溶解。(3)定量：分光光度计测量RNA浓度，保证OD260/OD280的比值为1.8-2.0为佳。(4)PCR方法和条件如下：逆转录合成第一链cDNA试剂加样量Total RNAOligo dT Primer（50M）dNTP Mixture（10 mM each）RNase free dH2O3g1l1lup to 10l反应条件：655min冰上急冷试剂加样量第一次反应混合物5PrimeScript?BufferM-MLV Reverse TranscriptaseRNase Inhibitor（40 U/l）PrimeScript?RTase（200 U/l）RNase Free dH2O总体积10l4l1l0.5l1l4.5l20l混匀反应条件：30C 10min，42C 60min，70C水浴15min合成cDNA第一链PCR扩增cDNA试剂加样量TaKaRa Taq（5 U/l）0.25l南京医科大学硕士专业学位论文1810PCR Buffer（Mg2+Plus）dNTP Mixture（各2.5 mM）cDNA引物1引物2灭菌蒸馏水5l4l1g1l1lup to 50l反应条件：9810s5530s 30个循环721 min727 min(5)琼脂糖凝胶电泳鉴定及半定量分析取琼脂糖1g加入100ml 1TAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，微波炉中火溶解；平衡凝胶槽，放好两侧档板，调节好梳子与底板距离，一般高出0.51mm；铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5g/ml的溴化已锭。将溶液轻轻混匀，待冷至50左右倒入凝胶槽，凝胶厚度一般为68mm；待凝胶彻底凝固后，去除两侧档板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端），使液面高出凝胶23mm，小心拔出梳子；将扩增产物与Loading buffer按4:1混合并加入凹孔中（样品不能溢出）；打开电源，调节电压至80V，约25min左右，电泳完毕，关闭电源，将凝胶放紫外灯观察，拍照；采用凝胶成像系统对电泳结果行图像扫描。2.6 MTT检测外源性SEMA 3A对SCC9细胞株增殖的影响(1)SCC9培养至对数生长期，0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数板计数。(2)调整细胞悬液体积达使其密度为2.0105/ml。(3)接种于96孔板上，分为4组，每组4个复孔，每孔总体积200l。设立南京医科大学硕士专业学位论文19对照组（不加外源性SEMA3A蛋白），另设立调零孔（只加培养液）。(4)4h后小心吸去培养液，换用200l/孔不含血清的培养液同步化。(5)24h后分别加入含终浓度250pM、500pM、1000pM外源性SEMA 3A蛋白的完全培养液，37、5%CO2培养箱培养24h。(6)于超净台环境内每孔加入5mg/ml的MTT试剂20l。(7)4h后小心去除上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150l，震荡5min。(8)490nm波长下酶联免疫检测仪测定各孔吸光度（OD）值。2.7 Transwell检测外源性SEMA 3A对SCC9细胞株迁移、侵袭的影响2.7.1迁移实验(1)SCC9培养至对数生长期，0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数板计数。(2)调整细胞悬液体积达使其密度为5.0105/ml。(3)采用24孔板Transwell小室进行迁移实验，上室接种SCC9细胞，细胞密度约为5105ml，细胞悬液约150l，下室为200l完全培养液。实验组上室细胞悬液中加入1000pM的外源SEMA 3A蛋白，对照组上室中不加外源SEMA 3A蛋白，37、5CO2常规培养24 h。(4)取出24孔板，用湿棉签将上室附着细胞小心擦去。(5)浸于苏木素染色5-10秒。(6)显微镜下计数穿过滤膜的细胞数，每张膜计数10个随机视野(100)。2.7.2侵袭实验(1)SCC9培养至对数生长期，0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数板计数。(2)调整细胞悬液体积达使其密度为5.0105/ml。(3)Transwell小室涂布Matrigel(25gcm2)，37聚合30min。(4)上室接种细胞浓度为5105ml的SCC9细胞悬液150l，下室为200l完全培养液。实验组上室细胞悬液中加入1000pM的外源SEMA 3A蛋白，对照组上室中不加外源SEMA3A蛋白，37、5CO2常规培养24 h。(5)取出24孔板，用湿棉签将上室附着细胞小心擦去。(6)浸于苏木素染色5-10秒。南京医科大学硕士专业学位论文20(7)显微镜下计数穿过滤膜的细胞数，每张膜计数10个随机视野(100)。结果1免疫组织化学检测结果显镜下观察，以肿瘤细胞中出现清晰棕黄色颗粒判定为阳性细胞，对于每例组织切片，高倍镜下随机选取10个视野，进行判定。结果显示，8/42例舌癌组织中SEMA 3A呈强阳性表达，16/42例舌癌组织中SEMA 3A呈阳性表达，18/42例舌癌组织中SEMA 3A呈阴性表达；8/15例正常舌组织中SEMA 3A呈强阳性表达，5/15例正常舌组织中SEMA 3A呈阳性表达，2/15例正常舌组织中SEMA 3A呈阴性表达。13/42例舌癌组织中NRP-1呈强阳性表达，24/42例舌癌组织中NRP-1呈阳性表达，5/42例舌癌组织中NRP-1呈阴性表达；0/15例正常舌组织中NRP-1呈强阳性表达，3/15例正常舌组织中NRP-1呈阳性表达，12/15例正常舌组织中NRP-1呈阴性表。SEMA3A、NRP-1在舌癌及正常舌体组织中的表达有显著性差异(P0.05)。（图1、表1、表2）。图1：SEMA3A、NRP-1在舌癌及正常舌体组织中的表达（免疫组织化学，200）。A.SEMA3A在正常舌组织中呈阳性表达；B.NRP-1在正常舌组织中呈阴性表达；C.SEMA 3A在舌癌组织中呈阴性表达；D.NRP-1在舌癌组织中呈阳性表达Figure1:The expression of SEMA 3A、NRP-1 in human carcinoma of tongue specimens andnon-malignant tongue tissues(Immunohistochemical staining,200).A.Positive南京医科大学硕士专业学位论文21immunohistochemical staining of SEMA 3A in non-malignant tongue tissues;B.Negativeimmunohistochemical staining of NRP-1 in non-malignant tongue tissues;C.Negativeimmunohistochemical staining of SEMA 3A in human carcinoma of tongue specimens;D.Positive immunohistochemical staining of NRP-1 in human carcinoma of tongue specimens.表1免疫组织化学检测舌癌及正常舌体中SEMA 3A的表达Tab 1 The expression of SEMA 3A in human carcinoma of tongue specimens andnon-malignant tongue tissuesSEMA 3A阳性率P值强阳性阳性阴性舌癌（42）8 16 18 57.1%P=0.040正常舌体（15）8 5 2 86.7%表2免疫组织化学检测舌癌及正常舌体中NRP-1的表达Tab 2 The expression of NRP-1 in human carcinoma of tongue specimens and non-malignanttongue tissuesNRP1阳性率P值强阳性阳性阴性舌癌（42）13 24 5 88.1%P0.05）（表3）；随访全组患者的1、3年生存率分别为76.2%、57.1%，SEMA3A阳性组的1、3年生存率分别为83.3%、62.5%，SEMA3A阴性组的1、3年生存率分别为66.7%、50.0%，两组间采用logrank分析，未见统计学差异。SEMA 3A强阳性组8人中仅1人于1年内死亡，余7人生存超过3年，1、3年生存率均为87.5%，高于SEMA 3A阴性组，但无统计学差异（表4）。NRP-1阳性组的1、3年生存率分别为75.7%、54.0%和NRP-1阴性组的1、3年生存率分别为80.0%、80.0%，两组间采用logrank分析，也未见统计学差异。在多因素logistic回归分析中，年南京医科大学硕士专业学位论文22龄对1年生存率的影响及淋巴结有无转移对3年生存率的影响有统计学意义。表3舌癌组织中SEMA3A与NRP-1的表达与临床病理的关系Tab 3 The expression of SEMA 3A and NRP-1 in the carcinorma of the tongue and therelationship with the clinical pathological factorsSEMA 3A NRP-1临床病理特征例数2值P值2值P值年龄（岁）1.437 P=0.231 0.001 P=0.98250 17 8 9 2 1550 25 10 15 3 22性别0.032 P=0.857 0.019 P=0.891女18 8 10 2 16男24 10 14 3 21病理分级0.389 P=0.533 0.227 P=0.63421 8 13 2 19+21 10 11 3 18淋巴结转移0.084 P=0.773 0.217 P=0.641无29 12 17 3 26有13 6 7 2 11肿瘤大小0.928 P=0.335 0.217 P=0.641T1+T2 29 11 18 3 26T3+T4 13 7 6 2 11临床分期0.656 P=0.418 0.019 P=0.891+24 9 15 3 21+18 9 9 2 16表4 SEMA 3A强阳性组1、3年生存率与阴性组的表达Tab 4 The comparison of 1-year survival rate and 3-year survival rate between stronglypositive expression of SEMA 3A and negative expression group+P值1年生存率87.5%(7/8)66.7%(12/18)P=0.2693年生存率87.5%(7/8)50.0%(9/18)P=0.070注：+代表强阳性组，代表阴性组2免疫细胞化学检测结果镜下观察以肿瘤细胞中出现清晰棕黄色颗粒为阳性判定标准，结果示SEMA3A在肿瘤细胞胞浆中未出现清晰棕黄色颗粒，NRP-1在肿瘤细胞胞膜及胞浆中出现清晰棕黄色颗粒，因此可见舌鳞状细胞癌细胞