DNA改组.doc

DNA改组及其研究进展周思(生工1101班 201124340105)摘要：自1994年首次提出至今，DNA改组已经成为定向进化最为有效的方法之一。无论DNA、 蛋白质还是生物体的进化，DNA改组都有十分突出的表现。改组技术已在新药物等领域取得了广泛的应用，极大地推动了现代生物科学和生物技术的发展。该技术同计算机强大的数据分析系统相结合，将会为后基因组学的发展提供强有力的技术平台。通过对十余年来DNA改组的发展作以简要综述，为日后相关研究的开展提供理论基础。关键词：DNA改组，定向进化，基因家族DNA shuffling and its research progressZHOU Si(Bioengineering Class 201101, 201124340105)Abstract: DNA shuffling has been one of the most effective directed evolution methods since reported in 1994. DNA shuffling performed well in the evolution of DNA, protein and organism.DNA shuffling procure broad application in many aspects, especially in pharmaceutical production, and drive the development of biological sciences and biotechnology. Moreover,taking advantage of tremendous data analysis power,DNA shuffling as a post genomics technology platform is being increasingly recognized. Development of DNA shuffling in recent 10 years was summarized for research.Keywords: DNA shuffling, directed evolution, DNA family1 前沿DNA改组是由美国的 Sr emmer于1994年首先提出，经后人的不断创新和改进，现已发展成为比较完善的技术体系1-2。作为一种高通量的突变和筛选技术，不仅可以实现基因序列的点突变，还可以实现其它突变技术不能实现的基因片段插入、缺失、倒转和整合等，而且可以反复改组，实现突变的优势积累效应3。现阶段该技术以无以伦比的优越性已发展成为比较普遍的研究核酸和蛋白质体外定向分子进化的一种强有的技术4-5。并以强大的生命力，已在基础理论研究、医药研究和工业酶改造等方面取得了令人瞩目的成就。2 DNA改组技术的基础研究2.1 DNA 改组的基本原理DNA 改组可分为如下4步：1、以单个基因或一组同源基因为模板, 用化学方法如脱氧核糖核酸酶I酶切或物理方法(如超声破碎法)将基因切割成一定大小的片段；2、由于这些小片段间具有一定同源性，可互为引物，故而可在不加引物的情况下通过PCR法将小片段组装成大片段，完成基因的重聚。当产物序列接近目的基因长度时，再加入合适的引物将大片段相连，得到一个重组基因文库，将此文库导入合适质粒，构建工程菌文库；3、选择合适的筛选方法(如平板筛选法、噬菌体表面展示技术等)，从工程菌文库中筛选出最佳的重组子；4、将得到的重组子基因，与初始的同源基因些小片段间具有一定同源性，混合在一起，作为第二轮DNA 改组的模板，重复上述步骤，直至得到所需的突变基因6。2.2 DNA 改组的特点2.2.1 DNA 改组技术可在短时间内实现蛋白质分子的定向进化蛋白质分子的自然进化需经历一段漫长岁月，往往长达几千年甚至几百万年。DNA改组技术的诞生使这个过程大大缩短，研究人员并不需要了解蛋白质进化过程的细节，只需在体外对基因进行随机诱变，然后从大量突变体中定向筛选出所需性质的突变体，工作效率更高。2.2.2 DNA 改组技术提高了分子进化的成功率在DNA 改组技术诞生前，随机诱变和定向诱变为常用的变异手段。随机诱变是通过易错PCR法对目的基因上的碱基进行随机替换，具有很大盲目性；而定向诱变需先了解目的基因及其所表达蛋白产物的三级结构、蛋白质功能、关键氨基酸所在位置等具体信息，若对此了解甚少，则很难采用该法。DNA改组技术是在易错PCR法基础上发展而来，得到的突变基因可和原型母本基因回交，通过多个循环使有益突变迅速积累，故能显著提高有益突变的产生频率7。2.2.3 DNA改组对筛选技术的要求较高 DNA 改组后所构建的突变体库十分庞杂，若要迅速从中获得有益突变体，必须采用合适的、高灵敏度及高通量的筛选方法。例如，对酶的最适pH和最适温度进行改良时，需通过测定酶促反应速度的方式(如荧光法和比色法)进行筛选。3 DNA 改组技术在现代生物工程中的应用8-113.1 蛋白质工程如DNA改组技术在蛋白质药物上的应用12蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗等。通常，蛋白质药物的分子量较大。与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确、有利于临床应用等特点。目前，DNA改组技术在国内得到的关注还不多，相关研究报道也较少。丙型肝炎病毒(HCV )基因组中的C区基因可编码核心蛋白，后者为宿主免疫反应攻击的主要靶抗原，有效的核心蛋白特异性免疫反应对于预防和清除HCV具有重要意义。赵甫涛等13对HCV基因组C区基因进行了DNA改组。3.2 酶定向进化14运用DNA 改组技术对酶进行定向改造，可改变酶的一系列性质如催化活性、稳定性及底物专一性。DNA改组技术在酶工程、代谢工程以及医药等领域都得到了广泛的应用，显示出巨大的应用价值。DNA改组技术对分子酶工程的发展具有重大的影响，已应用到提高酶活性、稳定性以及改变底物专一性等方面。3.2.1 提高酶的活性熊爱生等15选择大肠杆菌的GUS基因作为模板，通过DNA 改组技术构建了突变GUS基因的原核表达质粒库, 经高活性筛选, 获得了活性提高3倍的GUS基因。3.2.2 改变酶对底物的专一性利用DNA改组技术进行底物专一性改造的酶有-内酰胺酶、核酶、细胞色素C过氧化酶(CCP)、磷酸酯酶等。3.2.3 提高酶的稳定性 酶的稳定性易受温度、pH值和溶液浓度的影响，因此在工业应用中也受到一定的限制。应用DNA改组技术可以得到性能更为稳定的各种特定功能的酶, 满足工业生产的特殊需要。Kim YM等16对栖热菌IM6501菌株中具有热稳定性的麦芽糖淀粉酶进行了DNA改组，经过4轮改组和筛选，得到了具有高耐热性的麦芽糖淀粉酶。3.3 细胞因子定向进化细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。机体中许多细胞，尤其是免疫细胞，可合成和分泌多种细胞因子，以维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭及预防肿瘤发生；而在病理状态下，某些重要的细胞因子产生和分泌不足，会阻遏机体对细胞生长的正常调节，进而加剧病变过程。3.4 代谢工程1991年, Bailey 17 提出了代谢工程的概念，即利用DNA重组技术对细胞中涉及生化反应、物质运输及调控功能的关键性酶及蛋白进行改造，进而改善产物的性质、产量或细胞的性能。DNA改组技术及基因家族改组技术的诞生和日趋成熟，显著加快了代谢工程的发展速度。4 DNA改组的前景18DNA改组自1994年提出以来就受到多方关注。1997年，Stemmer依托五项美国专利成立了Maxygen公司，吸引了包括世界最大农业公司DuPont公司、抗生素巨头DSM公司和工业酶巨头NovoNordisk公司，还有美国国防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会(NIST)提供5项共计2100万美元的资助。随着深入应用，越来越多实验室加入DNA改组的相关研究中。综上所述，无论是基因的表达水平，还是产物的生物活性都可以应用DNA改组加以改进。但是，这需要我们在初级文库的建立、随即片段的产生和重组以及重组子的筛选等问题上作深入研究。DNA改组在生物丁程的各个领域中将创造出让世人瞩目的奇迹! 5 结语近年来， DNA改组技术已广泛应用于基因的定向进化，一系列改良的蛋白、酶、单克隆抗体及细胞因子由此被开发出来，并在农业、生物工程和基因治疗领域中发挥了巨大作用。对于那些三维结构不明确的蛋白，不需弄清其结构与功能间的确切关系就可实现高效进化，是DNA改组技术相比于以往的诱变技术所具有的不可比拟的优势；此外，随着DNA改组技术的不断发展，其研究对象也逐渐由单个基因的改组过渡到整个基因组的改组，因而大大提高了分子体外定向进化的效率。可以相信，生物方法取代传统的化学合成法将是大势所趋。参考文献1 Stemmer W P C. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly. Proc Natl A cad Sci U, 1994, 91(22): 1074710751.2 Stemmer W P C. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature, 1994, 370(6488): 389391.3 Pen nisi E. Molecular evolution: How the genome readies itself for evolution. Science, 1998, 281(5380): 11331134.4 Is alan M, Le merle C, Michalodimitrakis K. Evolvability and hierarchy in rewired bacterial gene networks. Nature, 2008, 452(7189): 840845.5 Sharakhov I V. Inversions and gene order shuffling in Anopheles gambia e A. Funest us. Science, 2002, 298(5591): 182185.6 李健炜, 陈建华. DNA改组在现代生物工程中的应用. 药学进展, 2010, 34(8): 344345.7 陈守义, 余新炳. DNA改组及其应用J. 热带医学杂志, 2002, 2(4): 387-3901.8 胡光星, 郭美锦, 储炬, 庄英萍, 张嗣良. DNA 改组技术发展与应用. 中国生物工程杂志, 2002, 22(3), 912.9 陈守义, 余新炳. DNA 改组及其应用. 热带医学杂志, 2002, 2(4): 387-389.10 俞 路, 王雅倩, 张 莹, 章世元, 李治学. DNA改组的发展及应用. 生物学杂志, 2008, 25(6): 58-60.11 刘国奇, 王海涛. DNA 改组-定向进化的技术革命. 军事医学科学院院刊, 2000 , 24(2): 130-134.12 李奇璋, 黄蕾, 周选围, 唐克轩. DNA改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用. 中国药物与临床, 2008 , 8(8): 589591.13 赵甫涛, 贾战生, 李谨革, 等. 丙型肝炎病毒C区的DNA改组J. 医学研究生学报, 2006, 19 (3): 195-1981.14 刘莹, 曹健, 王中太, 杨永刚, 黄亮. DNA 改组技术在酶工程中的应用. 生物技术通报, 2008, (3): 5556.15 熊爱生, 姚泉洪, 彭日荷. DNA 改组技术构建突变GUS 基因的原核表达质粒库. 中国生物化学与分子生物学报, 2003, 19(2) : 162167.