壳聚糖共价接枝碳纳米管_羟基磷灰石骨组织工程材料的制.doc

壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石骨组织工程材料的制备及表征#陈黎，胡静晓，沈新宇，童华*510152025（武汉大学化学与分子科学学院，武汉 430072）摘要：本文采用壳聚糖共价接枝碳纳米管结合原位沉淀法制备了壳聚糖-碳纳米管/羟基磷灰石复合材料。通过红外光谱分析，证明了壳聚糖与碳纳米管之间通过共价键连接。对比未添加碳纳米管的壳聚糖/羟基磷灰石复合材料，壳聚糖-碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的力学性能得到明显提高。碳纳米管的加入对复合材料中的无机粒子的形貌有着明显的调控作用，呈现出比较均一的纳米棒状结构。研究表明：碳纳米管增强相的加入以及共价接枝方法对碳纳米管与壳聚糖两相间结合力的提高，是复合材料力学性能提高的主要因素。关键词：羟基磷灰石；碳纳米管；壳聚糖；共价接枝中图分类号：Q811.7Preparation and characterization of chitosan-covalentlygrafted multiwalled carbon nanotubes/hydroxyapatitecomposite for bone tissue engineeringCHEN Li, HU Jingxiao, SHEN Xinyu, TONG Hua(College of Chemistry and Molecular Sciences,Wuhan University, WuHan 430072)Abstract: In this paper, a novel chitosan-grafted multiwalled carbon nanotubes/hydroxyapatite(CS-MWNTs/HA) composites were prepared through covalently grafting CS onto the surfaces ofMWNTs and in-situ precipitation method. Fourier transform infrared spectroscopy analysisshowed that CS was covalently grafted onto MWNTs. The addition of MWNTs can make theCS-MWNTs/HA composites resist significantly higher stress and greatly influenced themorphology of inorganic particles. The inorganic particles exhibited as nanosized rods withuniform particle size.The studies show that the stress of the composites was improved by theaddition of MWNTs and the effect of good interfacial bonding between MWNTs and CS throughcovalent modification.Keywords: hydroxyapatite; muliwalled carbon nanotubes; chitosan; covalent grafting300 引言羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是天然骨组织的主要无机成分，由于具有良好的生物相容性和和骨传导作用，在骨组织工程材料领域具有广泛的应用前景。但由于力学性能较差，脆性大和强度低，因此很大程度上限制了羟基磷灰石在人体某些承重部位的应用。近几3540年来，许多研究者采用多种复合的方法来提高材料性能1-3。壳聚糖（Chitosan，CS）是甲壳素脱去部分乙酰基的产物，由 N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体通过 -1,4-糖苷键链接起来的直链状高分子化合物，是一种常见的天然高分子4-5。壳聚糖具有良好的生物相容性，可以被人体内的酶降解，而且其降解产物是无毒的6。但由于壳聚糖的生物活性不足以应用于骨组织工程领域，它常常与羟基磷灰石复合，以求得到性能更加优异的骨组织替代材料7-9。为了探寻一种新的复合方法，人们选择具有高强度和韧性的增强相，以进一步改善羟基磷灰石的力学性能，并保持其良好的生物相容性。引入的增强相包括氧化锆10，丝素蛋白11，聚基金项目：国家自然科学基金(30900297 和 31071265); 教育部博士点基金(20090141120055)作者简介：陈黎，(1985-)。通信联系人：沈新宇，(1979-)，男，讲师，生物复合材料。E-mail: -1-乳酸12，聚酰胺 6613等。碳纳米管具有 sp2 杂化形成的 C=C 共价键，赋予了其极强的强度、韧性及弹性模量，使碳纳米管具有优异的力学性能。由于碳纳米管具有很大的比表面积和表面能，使得碳纳米管45505560657075容易团聚，这极大地限制了对其应用性能的研究。1994 年 Tsang 等14发现用强酸对碳纳米管进行切割可得到含活性基团（如羧基，羟基等）的碳纳米管，利用这些基团可以实现对碳纳米管的共价接枝，有效地提高了碳纳米管的溶解性。此后，许多研究者纷纷尝试用小分子或聚合物通过共价接枝的方法对碳纳米管进行表面修饰，该方法可以得到结合力更加牢固的碳纳米管的复合材料。本文尝试用一种新型壳聚糖共价接枝碳纳米管结合原位沉淀法15制备了壳聚糖-碳纳米管/羟基磷灰石（CS-MWNTs/HA）复合材料。首先通过多壁碳纳米管上的羧基与 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC) 偶合形成一个 O-异酰基脲结构，这一活化中间物再与壳聚糖上的氨基反应，再结合原位沉淀法得到了壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料。并对复合材料进行分析和表征。1 实验部分1.1 试剂和仪器壳聚糖（Mw 1000000，95%脱乙酰度，浙江金壳生物化学有限公司），羧基化多壁碳纳米管（MWNTs-COOH，直径 10-20 nm，长度 5-15 m，深圳纳米港有限公司），1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐（EDCHCl，试验试剂，上海共价化学科技有限公司），N-羟基丁二酰亚胺（NHS，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司），无水吗啉乙磺酸（MES，生化试剂，阿拉丁），戊二醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），四水硝酸钙（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），磷酸氢二铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。智能集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S，上海东玺制冷仪器设备有限公司），超声波清洗仪（SB5200，宁波新芝生物科技股份有限公司）。1.2 结构表征与性能测试扫描电子显微镜（SEM，Quanta 200，FEI，Netherlands）用于复合材料的表面结构观察。透射电子显微镜（TEM，2010FEF，JOEL，Japan）用于分析复合材料的超微结构观察。傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，170SX，Nicolet，USA）和 X-射线衍射仪 XRD, Xpert PRO,Panalytical, Holland)用于复合材料的结构分析。其中 SEM 工作条件为：加速电压 30 kV，束流 510-9 mA，工作距离 10 mm；TEM 工作条件为：加速电压 100kV；FTIR 工作条件为：溴化锂压片，分辨率 4 cm-1，扫描速度 30 次/秒，波数范围 100-4000cm-1。万能力学测试机（SHIMADZU，AGS-J，Japan）用来测试复合材料的抗压强度。1.3 原位沉淀法制备壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料在 30 mL 醋酸溶液（2 vol.%）里加入 0.24 g 的壳聚糖，在 45 下搅拌 2 h 得到透明的壳聚糖溶液。随后，在壳聚糖溶液中依次加入 1.32 g 四水硝酸钙和 0.33 g 磷酸氢二铵直至两种盐完全溶解，得到含有钙离子和磷酸根离子的壳聚糖溶液。在 20 mL 50 mol/L 的 MES 中加入一定量的 MWNTs-COOH 并超声 10 min，随后分别加入 50 mg NHS 和 380 mg EDCHCl，在室温条件下搅拌 30 min，并超声 30 min，再向其中加入含有钙离子和磷酸根离子的壳聚-2-80859095糖溶液，在室温条件下搅拌 24 h，最后，在 80 下向此混合液中加入 200 L 的戊二醛溶液（25 wt.%）作为交联剂。此后将该混合液在室温下静置 24 h 使溶液发生交联反应直至完全交联，得到黑色的水凝胶。在完全交联的水凝胶表面倾倒一定量的浓氨水，并将装有水凝胶的烧杯用封口袋封口。整个氨水渗透的过程持续 24 h 直至氨水完全渗透到水凝胶底部。由于氨水的渗透，水凝胶内部的 pH 值逐渐升高到 10 以上，在此碱性环境下，水凝胶中的钙离子和磷酸根离子原位沉淀为羟基磷灰石，这种原位沉淀的过程可以用下列化学反应式表述： 当凝胶中钙离子和磷酸根离子全部原位沉淀为羟基磷灰石之后，将此复合材料用去离子水反复冲洗直至洗脱液的 pH=7，得到壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料。通过改变 MWNTs-COOH 与 CS 的质量比分别为 2%，5%，8%和 11%，得到一系列壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料。1.4 原位沉淀法制备壳聚糖/羟基磷灰石复合材料壳聚糖/羟基磷灰石（CS/HA）复合材料也同样用原位沉淀法制备出来用作与壳聚糖共价接枝碳纳米管 / 羟基磷灰石复合材料的力学性能对比。其制备方法除了添加MWNTs-COOH 的那一部分外与 1.3 中所描述一致。2 结果与讨论2.1 壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的红外光谱分析从图 1a 可以看出 MWNTs 在 1736 cm 1处出现了羧基官能团的羧基吸收峰。CS-MWNTs/HA 复合材料的红外光谱图（图 1b）和 CS/HA 复合材料的红外光谱图（图 1c）100105所显示的特征峰与标准化学计量比的羟基磷灰石粒子的特征峰非常相似，其中波数在式。在图 1c 中，波数在 1638 和 1566 cm-1 处的特征峰分别对应为壳聚糖里酰胺 I（C=O）和氨基（-NH2）的特征振动峰。值得注意的是，CS-MWNTs/HA 复合材料的红外光谱图中，合材料酰胺键吸收峰的强度，这说明了在复合材料中多壁碳纳米管上的羧基与壳聚糖上的氨基发生反应形成了共价酰胺键，所在峰的位置与其他聚合物接枝碳纳米管形成酰胺键的红外光谱相似16。-3-10Ca2+6HPO42 +8OH =Ca10(PO4)6(OH)2()+6H2O (pH10)1092 ，1031，961，603 和 565cm 1 的特征峰分别对应羟基磷灰石中磷酸根基团不同特征振动模式，波数在 3570 和 632 cm 1 的特征峰分别对应羟基磷灰石中羟基的伸缩和弯曲振动模位于 1736 cm 1 处归属于 MWNTs 中羧基（C=O）的特征振动峰几乎看不见，而比较图 1b与图 1c，CS-MWNTs/HA 复合材料在 1638 cm 1 处酰胺键吸收峰的强度明显高于 CS/HA 复110115120125图 1 CS-MWNTs/HA 复合材料的红外光谱图Fig. 1 FTIR spectra of CS-MWNTs/HA composite;2.2 壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的 X 射线衍射分析图 2 为壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的 X 射线衍射图谱。从图中可以看到，无机成分的主要组成为羟基磷灰石（参照标准图谱库：PDF Card No. 9-432），2 角在 26和 32附近的衍射峰是羟基磷灰石的特征衍射峰，（002）和（211）晶面峰的拓宽表示无机粒子的粒径非常细小。2 角在 32附近的较宽衍射峰表明复合材料中羟基磷灰石粒子具有较低的结晶度。这种 CS-MWNTs/HA 复合材料的晶体结构与天然骨矿物（生物体内磷灰石）的晶体结构非常相似17，都具有较低的羟基磷灰石结晶度。图 2 CS-MWNTs/HA 复合材料的 XRD 图Fig.2 XRD pattern of CS-MWNTs/HA composite2.3 壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的形貌图 3a 是利用原位沉淀法制备的壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的形貌特-4-征图。从图 3a 可以看出，羟基磷灰石无机粒子在 CS-MWNTs 基质中的分散比较均匀且紧密，无机相和有机相之间没有明显的分层，无机粒子的尺寸均为纳米级别，一般的机械复合方法是难以得到分散达到如此水平的有机/无机复合，同时无机相和有机相之间紧密的结合有益130135140145150155160于提高复合材料的力学性能，这主要归因于原位沉淀法的优越性。对比 CS-MWNTs/HA 复合材料的表面形貌（图 3a）和 CS/HA 复合材料的表面形貌（图3b），可以看到单纯的 CS/HA 复合材料中无机粒子为纳米球状颗粒，直径在 80 nm 左右。而 CS-MWNTs/HA 复 合 材 料 中 无 机 粒 子 为 棒 状 结 构 ， 直 径 约 为 60-90 nm。 分 析CS-MWNTs/HA 复合材料这种棒状无机粒子形成的原因可能是壳聚糖通过自身内在的隔室化效应，对钙离子、磷酸根离子以及碳纳米管在凝胶内部的分散起到了非常重要的作用。同时，凝胶内部的网格也限制了碳纳米管在凝胶内部的随意迁移，从而使碳纳米管能够更均匀地分布在整个壳聚糖凝胶中。在壳聚糖水凝胶的网格隔室这种微环境中，存在于隔室中的碳纳米管表面的部分羧基（另一部分羧基与壳聚糖上的氨基共价接枝）和羰基基团很有可能在羟基磷灰石晶体最初形成时，成为晶体生长过程中异相成核位点中心。这些带负电的基团或极性基团往往通过静电吸引、键合或螯合带正电的钙离子从而为羟基磷灰石晶体的形成起到成核位点的关键作用18,19。正由于这种相互作用，当添加氨水后，pH 值逐渐上升，碳纳米管表面上的部分羧基吸引体系中周围的 Ca2+离子从而形成局部过饱和度，Ca2+离子所形成的米棒状结构离子。图 3c 为壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的透射电镜图。从图中可以明显看到复合材料中确实存在碳纳米管，碳纳米管的直径为 10 nm 左右。(a) SEM: CS-MWNTs/HA (b) SEM: CS/HA (c) TEM: CS-MWNTs/HA图 3 CS-MWNTs/HA 复合材料的 SEM 和 TEM 图Fig 3. SEM and TEM micrographs of CS-MWNTs/HA composite2.4 壳聚糖共价接枝碳纳米管/羟基磷灰石复合材料的力学性能测试将复合材料自然干燥后，用万能力学测试机检测了不同碳纳米管/壳聚糖质量比的CS-MWNTs/HA 复合材料的力学性能。图 4a-e 所示的是 MWNTs/CS 质量比从 0 到 11%的CS-MWNTs/HA 复合材料和 CS/HA 复合材料在固定压缩速度 0.5mm/min 下的应力-应变变化对比曲线图。可以看到，添加碳纳米管的 CS-MWNTs/HA 复合材料和未添加碳纳米管的CS/HA 复合材料有着类似的应力-应变行为。另外，随着 MWNTs/CS 质量比从 0 增大到 11%，复合材料在相同应变状况条件下应变力不断增大。分析其原因主要是因为 1. 碳纳米管本身就具有优异的力学性能；2. 碳纳米管与壳聚糖的共价接枝反应得到了结合力较牢固的CS-MWNTs/HA 复合材料。-5-强静电又吸引附近的 PO43 离子，从而使得纳米羟基磷灰石在碳纳米管表面生长、沉积为纳图 4 不同 MWNTs/CS 质量比的 CS-MWNTs/HA 复合材料的应力-应变曲线对比图Fig. 4 Compressive stress-strain curves of CS-MWNTs/HA composite with different MWNTs/CS weight ratio1651703 结论本文采用壳聚糖共价接枝碳纳米管结合原位沉淀法成功制备了壳聚糖-碳纳米管/羟基磷灰石复合材料，用 FTIR，XRD，SEM，TEM 等手段对复合材料进行表征，发现壳聚糖上的氨基与碳纳米管上的羧基发生了共价反应得到了酰胺键。同时，随着 MWNTs/CS 质量比从 0 增大到 11%，复合材料在相同应变状况条件下应变力不断增大。说明碳纳米管的加入以及碳纳米管与壳聚糖间的共价接枝反应得到的牢固结合力对复合材料的力学性能有明显的帮助，可在骨组织工程领域得到广泛应用。致谢感谢国家自然科学基金（30900297 和 31071265）和教育部博士点基金（20090141120055）的支持。175参考文献 (References)1 HE J Q, YANG X P, MAO J F, et al. 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