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GAPDH抗体大全总有一款合适的GAPDH抗体在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。当然除了GAPDH抗体，-Actin抗体、-Tubulin抗体等也是最常见的内参抗体。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。选择合适的GAPDH抗体显得尤为重要，首先GAPDH的WB检测条带大约为36kDa，因此对于一些待检测分子量大于40kDa或者小于30kDa的目的蛋白尤为合适。一般来说，国产的抗体在质量稳定性、效价等方面存在不足，但是进口品牌如Abcam、Millipore、CST等价格偏高，一般在￥3000/100ul左右。下面我们为您推荐三款GAPDH原装进口抗体，分别是美国EarthOx和ProteinTech的产品。EarthOx的Anti-GAPDH Monoclonal Antibody（货号E021010）是小鼠源的单抗，其效价很高，厂商推荐的WB起始稀释比率为1:1000，实际应用过程中，有使用1:10000或更高的报告，远远高于此稀释比率，说明其免疫效价很高，另外，其检测种属也很多，包括人、牛、猪、小鼠、大鼠等。右图为EarthOx的Anti-GAPDH Monoclonal Antibody（货号E021010）在不同细胞系内WB的检测结果。货号 品牌 品名 来源 应用类型 特点 说明书 E021010 EarthOx Anti-GAPDH Monoclonal Antibody 小鼠 WB, IF 效价极高，检测种属多 点击 10494-1-AP ProteinTech GAPDH Polyclonal Antibody 兔 WB, ELISA 兔源 点击 60004-1-Ig ProteinTech GAPDH Monoclonal Antibody 小鼠 WB, ELISA, IHC, IF 应用类型多 点击 ProteinTech的GAPDH Polyclonal Antibody（货号10494-1-AP）则是一款兔源多克隆GAPDH抗体，对于需要兔源GAPDH抗体的客户则是一个不错的选择。同样，ProteinTech的GAPDH Monoclonal Antibody（货号60004-1-Ig）则是另一款单克隆抗体，除了WB和IF外，还可以应用于免疫组化IHC等实验。需要注意的是IF也是GAPDH抗体常用的应用类型之一。左图为ProteinTech的GAPDH Monoclonal Antibody（货号60004-1-Ig）抗体在石蜡包埋、福尔马林固定的切片上的应用。更多GAPDH内参抗体以及其他如Actin、Tubulin等其他内参抗体，请电话垂询。美国EarthOx品牌是一 家提供高性价比免疫学和细胞学科研产品及解决方案的品牌，*捷将其引入中国，作为其中国区域代理，将为客户提供最具性价比的常规免疫学试剂，如各种标签抗体、内参抗体、常规一抗以及全系列二抗，抗体检测底物以及相关试剂盒等。同时我们作为多家国际知名品牌的的中国代理或区域代理，能为您提供系列的实验室解决方案。如果您对上述产品感兴趣，请致*捷科技有限公司垂询相关的产品信息及完整实验解决方案。Western Blot 内参选择发布日期：2008-5-17 共阅11724次WesternBlot内参选择要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。 内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。 然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。 在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。在Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有一下三种。第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可；第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。第三种，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！ actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。 actin几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin之间具有较高的序列相似性(90%)。-actin是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作-actin内参时首先得保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列。公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原，可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除非肌细胞外,还可以检测cardiac，skeletal，smooth muscle细胞的actin。实际上,公司所制备的beta-actin抗体确实存在上述情况. 1, 选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗).这类的抗体占大多数,主要有santa cruz(sc-69879),sigma(A1978等),ProSci(Catalog No.: 3779),Cell Signaling(#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等。这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。相关网址如下：/products/4967.html/datasheet-69879-beta-actin-ac-15-antibody.html/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/A1978/Antibody-TDS/3779%20B-actin.html/actin-related_products-BET-A300-491/opfa.1.1.BET-A300-491.1916.4.1.html2, 选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体。主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).相关网址如下:/actin-related_products-PSC-3777/opfa.1.1.PSC-3777.1301.4.1.html/products/1784-1.php/products/1854-1.php这类抗体便可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号.最为明显的区分可以见Cell Signaling公司和EPITOMICS公司免疫组化的结果(顺请wxq2005fw指教):/products/4967.html/products/1854-1.phpWB常用内参及其技术参数内参名称 分子量大小 适用范围 beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞 GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞 beta -Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞 VCDA1/Porin 31kDa 线粒体 COXIV 16kDa 线粒体 TBP 38kDa 细胞核名称：抗Alpha/Beta Tubulin内参抗体产品货号：10759-1-AP规格：50ul 150ul产地：美国品牌商标：Proteintech供应商：Proteintech数量：批量英文名：TUBA4A Polyclonal Antibody保存条件：-20度保存一年保质期：1年应用范围：ELISA,免疫组化,western blot抗原：大肠杆菌内重组表达的人源Alpha-Tubulin蛋白（C末端1-323氨基酸残基）抗原来源：兔抗体来源：兔单克隆：否适用物种：人,大鼠,小鼠抗Alpha/Beta Tubulin内参抗体-Tubulin抗体-Tubulin抗体-Tubulin抗体|Proteintech在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。其中-Actin抗体、-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为最常见的三种内参抗体。Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为、等多种tubulin，其中-tubulin和- tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种tubulin。-tubulin和- tubulin分子量分别为55kDa和50kDa，其实际检测条带均在55kDa左右。-tubulin和-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Bloting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。PROTEINTECH GROUP作为一家拥有独立品牌的抗体公司，成立九年以来，致力于开发针对所有人类蛋白的抗体人类抗体组计划，迄今已生产出针对10,000种不同人类蛋白的10,000余种抗体，涵盖了生命科学的各个研究领域。产品被发表在各大学术期刊的论文频繁引用，在国际学术界建立了独具特色的品牌和牢固的地位，是本领域内近年出现的佼佼者.针对-tubulin和-tubulin内参抗体，艾美捷有多种不同样式产品供您选择。艾美捷提供的所有内参抗体均为原装进口包装，且备有现货。艾美捷提供的所有优质内参，条带清晰，高效敏感，能为您