CD4+CD25+调节性T细胞对哮喘大鼠免疫功能影响.docx

CD4+CD25+调节性T细胞对哮喘大鼠免疫功能影响来源：创新医学网作者：薛克营,金卫国*,王成国,程立作者单位：郧阳医学院附属东风医院呼吸内科,湖北 十堰【摘要】 目的:观察CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+ Treg)对CD4+CD25-T细胞增殖和Th1/Th2细胞因子分泌的影响，探讨其在哮喘气道炎症中的作用机制。方法:将哮喘大鼠CD4+CD25- T细胞分别与卵白蛋白(OVA)免疫耐受大鼠CD4+CD25+ Treg细胞和哮喘大鼠CD4+CD25+ Treg细胞联合培养，3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测量细胞增殖情况，ELISA检测细胞IL-4、IL-5和IFN-含量。结果:OVA耐受大鼠CD4+CD25+ Treg细胞能抑制CD4+CD25-T细胞增殖和Th2细胞因子分泌(P0.05);哮喘大鼠 CD4+CD25+ Treg细胞可明显抑制IFN-的分泌(P0.05)。结论:OVA免疫耐受大鼠CD4+CD25+ Treg细胞可能通过抑制哮喘大鼠CD4+CD25- T细胞增殖和影响Th1/Th2平衡发挥作用，哮喘大鼠CD4+CD25+ Treg细胞存在功能异常，可能与哮喘的发病有关。【关键词】 CD4+CD25+调节性T细胞;哮喘Effect of CD4+CD25+ Regulatory T Cells on the Immunologic Function in Rats with Asthma XUE Ke-ying,JIN Wei-guo*,WANG Cheng-guo,CHENG Li,YANG Zhong-wei,WANG Zheng-yan (Department of Respiratory Medicine,Dongfeng Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442008,China)Abstract:Objective To investigate the effects of CD4+CD25+ regulatory T cells (CD4+CD25+ Treg) on the proliferation of CD4+CD25- T cells and the secretion of Th1/Th2 cytokines,and to explore its role in the mechanism of airway inflammation.Methods CD4+CD25- T cells of asthmatic rats were co-cultured with CD4+CD25+ Treg of OVA-immune tolerant rats or CD4+CD25+ Treg of asthmatic rats,respectively.The proliferation of CD4+CD25- T cells was detected with 3H-thymidine ribotide (3H-TdR) incorporation,the contents of IL-4,IL-5 and IFN- were determined with ELISA.Results The proliferation of CD4+CD25- T cells and secretion of Th2 cytokines were significantly inhibited with CD4+CD25+ Treg of OVA-immune tolerant rats(P0.05),and the secretion of IFN- was significantly inhibited with CD4+CD25+ Treg of asthmatic rats(P0.05).Conclusion CD4+CD25+ Treg of OVA-immune tolerant rats could alleviate the airway inflammation of asthmatic rats through inhibiting the proliferation of CD4+CD25- T cells and secretion of Th1/Th2 cytokines.The abnormal function of CD4+CD25+ Treg in asthmatic rats may relate with the pathogenesis of asthma.Key words:CD4+CD25+ regulatory T cells;Asthma活化CD4+CD25+ Treg细胞具有免疫抑制性特征，其机制在于该细胞表达细胞毒性T细胞抗原4 (CTLA-4)1，CTLA-4单克隆抗体可以阻断CD4+CD25+ Treg细胞的抑制作用，而且CD4+CD25+ Treg细胞还可以通过分泌细胞因子IL-10、转化生长因子-(TGF-)发挥免疫抑制效应2。但有研究发现哮喘患者CD4+CD25+ Treg细胞数量和功能下降3。本研究通过观察CD4+CD25+ Treg细胞对哮喘大鼠CD4+CD25- T细胞的增殖和Th1/Th2细胞因子分泌的影响，探讨CD4+CD25+ Treg细胞在哮喘中的作用机制。1 材料和方法1.1 主要仪器与试剂免疫磁珠细胞分选器、LD分选柱、MS分选柱、大鼠CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit(德国美天旎生物技术公司);LS-6500型液闪计数仪(美国Meckman公司);NOVAPTH-MIPEADER型酶标仪(荷兰BIO-RAD公司);羊抗鼠IL-4 、IL-5、IFN- ELISA Kit(深圳晶美公司)。1.2 动物模型制备健康雄性Wistar大鼠30只(同济医学院实验动物学部提供)，鼠龄23月，体重180230 g，SPF级。哮喘模型及OVA免疫耐受大鼠模型制备方法参照文献4，5进行;CD4+CD25+ Treg细胞及CD4+CD25- T细胞分离方法参照文献6进行。1.3 CD4+CD25+ Treg细胞抑制反应将哮喘大鼠CD4+CD25- T细胞分别与卵白蛋白(OVA)免疫耐受大鼠CD4+CD25+ Treg细胞(A组)、哮喘大鼠CD4+CD25+ Treg细胞(B组)联合置24孔细胞培养板中(均为1106个)，细胞培养液为RPMI 1640 + 10%胎牛血清，刺激物为包被在培养孔中的抗CD3单克隆抗体(10 mg/L)、可溶性的抗CD28单克隆抗体(10 mg/L)和OVA(20 mg/L)。细胞培养板置5% CO2培养箱、潮湿环境下37 培养48 h，收集上清冻存于-80 冰箱中待用。继续培养48 h后每孔加37 kBq/L的3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)。收获细胞于999型纤维膜，烤干后加闪烁液，用LS-6500型液闪计数仪测定T淋巴细胞DNA合成所结合的3H-TdR(闪烁次数/min)，即反映淋巴细胞增殖能力。CD4+CD25- T细胞作为自身对照(C组)。1.4 IL-4、lL-5和IFN-检测按试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm比色，测量样本、标准品吸光度，绘制标准曲线，计算样本细胞因子IL-4、IL-5和IFN-含量。1.5 统计学处理实验数据采用SPSS 10.0软件进行统计，所得结果以均数标准差(xs)表示，组间比较采用t检验，取P0.05有统计学意义。2 结果2.1 CD4+CD25+ Treg细胞对CD4+CD25- T细胞的抑制作用A组液闪次数(167.2327.43次/min)较B组(371.7351.68)和C组(723.7693.52)明显下降，差异有显著性(P0.05);与B组比较， A组下降尤为显著(P0.05)。2.2 CD4+CD25+ Treg细胞对Th1/Th2细胞因子分泌的影响见表1。A组与B组IL-4、L-5的水平较C组明显下降，其中尤以A组下降为明显，差异有显著性(P0.05);与B组相比，A组IL-4与IL-5的水平明显下降，差异有显著性(P0.05);与C组相比，B组IFN-水平明显下降，差异有显著性(P0.05)。表1 CD4+CD25+ Treg对各组细胞IL-4、IL-5及IFN-的影响(略)注：与C组比较，*P0.01,*P0.05，#P0.05;与B组比较，*P0.05，#P0.053 讨论支气管哮喘是由多种细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病7。其中淋巴细胞产生Th1、Th2细胞因子失衡在哮喘的发病机制中起重要作用8-10。CD4+ T淋巴细胞根据产生细胞因子类型不同而分为Th1、Th2细胞亚群。Thl 细胞主要分泌IL-2、IFN-，诱导巨噬细胞活化和迟发型超敏反应，也可诱导B细胞产生IgA、IgG、IgM，但不产生IgE;Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13，诱导肥大细胞、嗜酸性粒细胞生长、分化和产生包括IgE在内的免疫球蛋白。其中IFN-、IL-4是Th1和Th2细胞特征性的细胞因子。Th1、Th2细胞因子可促进本亚群和抑制另一亚群的生长、分化。Thl细胞产生的IFN-能抑制Th2细胞的增殖和IL-4依赖的IgE合成;Th2细胞产生的IL-4、L-10可通过加强IL-4分泌，促进Th2细胞分化，抑制Th1细胞分化11-13。支气管哮喘存在T细胞尤其是Th2的过度活化，并认为Th2优势应答是哮喘发病的始动因素和进展因素。分泌增加的Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等可以诱导IgE产生，刺激嗜酸性粒细胞增殖、活化，进而通过分泌多种促炎介质引起呼吸道炎症和支气管痉挛。Th1型细胞因子IL-2、IFN-等参与Th1细胞分化的调节，能够抑制Th2细胞因子IL-4、IL-5的产生，并阻断IgE的合成，从而有效地抑制变应原诱导的气道高反应性。由于Th1/Th2细胞因子之间相互作用的失衡在哮喘的发病机制中具有十分重要的意义，因此研究CD4+CD25+ Treg细胞对效应性CD4+ T细胞增殖及Th1/Th2细胞因子分泌的影响利于阐明其在哮喘发病中的作用。本研究通过体外实验证实OVA免疫耐受大鼠的CD4+CD25+ Treg细胞能够抑制效应性CD4+ T细胞增殖，抑制Th细胞因子尤其是Th2的分泌，纠正Th1/Th2失衡，进而使气道炎症减轻，缓解哮喘症状。但OVA免疫耐受大鼠CD4+CD25+ Treg细胞未能明显抑制哮喘大鼠效应性CD4+ T细胞IFN-的分泌，推测可能和IL-4、IL-5水平明显下降后，增强Th0向Th1分化能力，使CD4+ T细胞大量向Th1分化和活化并大量分泌IFN-有关。哮喘大鼠自身的CD4+CD25+ Treg细胞虽能抑制CD4+CD25- T细胞的增殖和IL-4、IL-5分泌，但该能力明显弱于OVA免疫耐受大鼠CD4+CD25+ Treg细胞，且不能提高IFN-水平，因此不能纠正Th1/Th2细胞因子的失衡，导致了哮喘慢性气道炎症的发生和发展，提示哮喘大鼠的CD4+CD25+ Treg细胞存在功能缺陷。本研究表明CD4+CD25+ Treg细胞系通过抑制CD4+CD25- T细胞的增殖和影响Th1/Th2细胞因子的分泌发挥作用;哮喘大鼠CD4+CD25+ Treg细胞的抑制功能异常可能和哮喘慢性气道炎症的发生和发展有关。【参考文献】1 Kingsley CI,Karim M,Bushell AR,et al.CD4+CD25+ regulatory T cells prevent graft rejection:CTLA-4- and IL-10-dependent immunoregulation of alloresponsesJ.J Immunol,2002,168(3):1 080-1 086.2 Maloy KJ,Salaun L,Cahill R,et al.CD4+CD25+ T(R) cells suppress innate immune pathology through cytokine-dependent mechanismsJ.J Exp Med,2003,197(1):111-119.3 薛克营，周咏明，熊盛道，等.支气管哮喘患者外周血CD4+CD25+ 调节性T水平及Foxp3 mRNA表达的分析J.中国医师进修杂志,2006,29(9):11-13.4 Xue KY,Zhou YM,Xiong SD,et al.Influence of Danshen injection on airway inflammation and CD4+CD25+ regulatory T cells of asthmatic ratsJ.Journal of Nanjing Medical University,2006,20(5):292-295.5 薛克营，熊盛道，熊维宁，等.鼻内滴入卵白蛋白诱导大鼠免疫耐受模型的建立J.中国现代医学杂志，2006,16(18):2 770-2 772.6 王成国，薛克营，程 立，等.磁激活分选法双重分离大鼠外周血单个核细胞CD4+CD25+调节性 T细胞J.郧阳医学院学报,2008,27(4):295-297.7 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南J.中华结核和呼吸杂志,2003,26(3):132-138.8 Rojas Ramos E, Martnez Jimnez 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