分子生物学综合大实验.doc

分子生物学综合大实验 -自由基对质粒氧化损伤的观察 指导教师： 李发荣老师 学 生：刘宽（40908251）、霍明秀（40908262）、陈露（40908265）、徐保丽（40908270）、刘静（40908271）专 业： 生物技术 班 级： 09生物技术 一、 实验目的1. 复习并掌握质粒的提取方法；2. 设置不同梯度氧化剂，对比其对质粒的损伤程度；3. 观察自由基对质粒的氧化损伤，分析自由基对氧化质粒损伤的分子机制。二、 实验原理1. 质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱性条件被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中。这样通过加热或碱处理后又PH中和，再用沉淀离心的方法就可把质粒DNA提取出来。 2.自由基：指任何含有一个或多个未配对电子并能独立存在的基团，它广泛存在人及其他生物体内，它包括氧自由基OFR及活性氧ROS，而ROS包括OFR( O2、OH、RO、ROO、1O2、H2O2、ROOH)及Un OFR（H.、R),其中O2 、OH 最重要。3.质粒的自由基氧化损伤：在生命体系中，DNA是活氧进攻的目标，尤其是羟基自由基(p0OH)13。活性氧的进攻，会导致DNA的损伤，包括单链损伤、双链损伤、释放自由碱基以及戊糖环的损伤等。DNA的损伤会导致生物体的老化、癌变等多种病变47。但这些现象的产生分子机制是怎样的，为观察对核酸的损伤程度，真核生物的DNA不易提取，而质粒为DNA环状分子，易提取，且质粒被广泛用到基因重组，基因克隆等研究中，所以观察自由基对质粒的氧化损伤对抗氧化酶开发、生物育种、药物开发等有着相当大的意义。三、实验材料、试剂与仪器1. 材料：含质粒的E. coli DH5a, JM109, Top10 菌株；2. 试剂：30%H2O2，FeSO4.7H2O，琼脂糖（agarose）、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、氨苄青霉素母液、溶液溶液、溶液、饱和酚溶液、氯仿、无水乙醇、TE缓冲液、70%乙醇、蒸馏水等；3. 仪器及耗材：电泳仪、凝胶图像扫描仪、冰箱、恒温摇床、超净工作台、水浴锅、冷冻离心机、电子天平、高压灭菌锅、50ml的烧杯、100ml容量瓶、150ml锥形瓶、1.5ml的EP管多个、微量移液器，牛皮纸、玻璃棒、纱布、棉线、标记笔、秤量纸、吸水纸、PE手套、冰盒等。附：试剂的配置（1）Solution I 50mmo1L 葡萄糖 5mmo1L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)TrisHCl(pH8.0) 1.0 mmo1L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)可成批配置，每瓶100ml，高压灭菌15min,贮藏于4冰箱。（2）Solution II 0.4mo1L Na0H，2SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合（3）Solution III 5mo1L 醋酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 高压灭菌。（4）TE缓冲液 10mmo1L TrisHCl 1mmo1L EDTA(pH8.0)（5）胰RNA酶(RNA酶A) 将RNA酶溶于10mmo1L TrisHCl(pH7.5)、15mmo1L NaCl中，配成10 mgmL的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20。（6）酚氯仿 混合饱和酚：氯仿=1:1（7） 5TBE 缓冲液 Trig54g, 0.5mol/LEDTA(pH8.0)20ml, 硼酸27.5g,定容至1000ml。（8）Tris 54g , 27.5g , 0.5mol/lEDTA(PH 8.0) 20ml.（9）NAAC(3mol/l） NaAc.3H2O 40.81， DH2O 50ML, 加水定容至100ml,乙酸调PH5.2，高压灭菌，4度保存。（10）6上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。四、实验步骤1.配置LB溶液培养基a.称量 按培养基配方比例(每升LB培养基的配方如下：酵母提取物pH5g、蛋白胨10g、NaCl10g、水1000ml、pH7.47.6)依次准确的称取酵母提取物2.5g、蛋白胨5g、NaCl5g放入烧杯中。蛋白胨很容易吸潮，在称取时动作要迅速。另外称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，在称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。b.溶化 在上述烧杯中科先加入少于需要的水量，用玻璃帮搅匀，然后，在石棉网上加热，使其溶解。待药品完全溶解后，不想红水分到所需的总体积。c.调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时使用pH试纸测其pH值，知道pH达到7.6.反之，则用1mol/LHCL进行调节。注意pH不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。d.分装 按实验要求，可将配置的培养基分均匀装入3个三角烧瓶内。分装时不要使培养基沾在瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。e.加塞 培养基分装完毕后，在三角烧瓶口上塞上棉塞，一阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。f.包扎 加塞后，将全部三角烧瓶用麻捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮值，一防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。g.灭菌 将上述培养基于121.3,20分钟高压蒸汽灭菌。h.将灭菌的培养基放入37的温度中培养2448小时以检查灭菌是否彻底。2.接种用无菌牙签挑取含质粒的E. coli DH5a, JM109, Top10 菌株接种到上述灭过菌的LB液体培养基中，再加入配好的氨苄青霉素溶液，37，200r/min振荡培养约12小时至对数生长后期。3.提取质粒（碱裂解法）a.取1.5ml培养液加入1.5ml的EP管中，4，12000r/min离心3min.弃上清液，将管倒置于吸水纸上13min,使培养基流尽。菌体沉淀重悬浮于100uL溶液I中，激烈振荡，室温下放置510min。b.加入200uL新配置的溶液II，盖紧管口，快速温和颠倒管35次裂解细胞，使DNA变性，冰浴5min。变性的时间不要过长，否则质粒易被打断。c.加入150uL预冷的溶液III，盖紧管口，快速温和颠倒EP管10s,使DNA复兴，沉淀混匀，冰浴10min。4,12000r/min离心10min。复兴时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。要根据菌体的量调节加入溶液的体积，保持溶液I:溶液II:溶液III=1:2:1.5。d.上清液移入干净EP管中，加入等体积的酚-氯仿，轻柔振荡混匀，室温放置放置分层。4，12000r/min离心5min。e.小心将上层水相移至干净EP管中，加入2倍体积预冷无水乙醇或1倍体积异丙醇，振荡混匀后置于-20冰箱中30min以上。用预冷的乙醇或丙醇，适当延长-20冰箱中静置时间，加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2),均有利于沉淀完全。g. 4, 12000r/min离心10min,弃上清液，将管口敞开倒置于吸水纸上是所有液体流出，加入1ml70%乙醇漂洗沉淀依次，洗去盐类等杂质。4, 12000r/min离心10min，吸除上清液，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，真空干燥10min或室温干燥。h.将沉淀溶于20uLTE缓冲液中，贮于-20冰箱中。TE中得EDTA能螯合一些离子，抑制DNase;且其pH8.0，可防止DNA发生酸水解。4.DNA琼脂糖凝胶电泳a.凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴配置1%凝胶，量取20ml并加入20lEB灌入水平胶框胶框，插入梳子，自然冷却。b.样品配置与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U型条带，可改用2.5%Ficoll代替蔗糖或甘油。c.电泳 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增强时，较大的FNA片段迁移率的增加相对较小。但随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜超过5V/cm。d.染色和拍照 用紫外分析仪拍照，并进行分析。5 芬顿体系对质粒的氧化 A.称取0.04gFeSO4.7H2O，加10ml蒸馏水，混匀；b.取1.5ml的离心管3个，分别加入上述提取的质粒10ul与1ulFeSO4溶液，编上号，1号中加入无菌水10ul，2号加入2ul的H2O2与8ul无菌水，3号加入8ul的H2O2和2ul无菌水，放置10分钟。6. 结果的检测 取10ul上述反应后质粒，与溴酚蓝上样液混合，1%琼脂糖凝胶电泳.扫描电泳结果并采集图像，利用ImageMaster TotalLab v1.00软件对图像进行分析，通过测定DNA 各条带超螺旋带（Supercoiled DNA，SC）、开环带（Open Circle DNA，OC）、线性带（Linear DNA，LI）的光密度值（Pixel），对比分析。5、 实验结果所提质粒电泳图：(图中最右侧为Mark,左边五条带均为所提取的质粒)质粒氧化损伤电泳图（图中最左侧为Mark，从左数第二、第三、第四条带依次为对照组、低剂量组、高剂量组）6