保加利亚乳杆菌在牛羊乳基质中发酵性能差异的比较.doc

保加利亚乳杆菌在牛羊乳基质中发酵性能差异的比较王秀玲收稿日期：基金项目：西北农林科技大学人才基金资助项目(22050205)*通讯作者：葛武鹏（1965），男，博士，副教授，研究方向：乳品科学及生物技术。E-mail： 作者简介：王秀玲（1986），女，硕士研究生，研究方向：功能性乳制品。E-mail：，葛武鹏1，田毅1，王迁2，秦立虎3，张旺倩1（1. 西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌，712100；2.陕西杨凌质量技术检测检验所，陕西 杨凌，712100；3. 西安奶业科学研究所，陕西西安，710065）摘 要：探讨了德氏保加利亚乳杆菌（L. Bulgaricus）在牛、羊乳基质中的增菌规律及产酸、产香性能，并对其差异性进行了比较。结果表明：以羊乳为基质42发酵8h活菌数最高可达2.10109mL-1，pH值降至4.160.07，滴定酸度(128.003.61)T，丁二酮质量浓度（11.720.25）mg/L，乙醛质量浓度（6.090.22）mg/L；以牛乳为基质相同条件发酵活菌数最高可达1.25109mL-1，pH值降至4.450.08，滴定酸度（114.801.31）T，丁二酮质量浓度（11.560.11）mg/L，乙醛质量浓度（5.120.38）mg/L。结论：L. Bulgaricus以牛、羊乳为基质42发酵8h，其产丁二酮能力差异不显著；而增菌效率、产酸及产乙醛能力差异极显著，L. Bulgaricus在羊乳基质中发酵性能优于牛乳。关键词：保加利亚乳杆菌；牛乳；羊乳；发酵性能 中图分类号： 献标识码： 文章编号： Comparison of the fermentation properties differences of L. Bulgaricus in cows & goats milkWANG Xiu-ling1, GE Wu-peng1*, TIAN Yi1, WANG Qian2, QIN Li-hu3, ZHANG Wang-qian1(1. College of Food Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Institution of inspection of Yangling bureau of quality and supervision，Yangling 712100, China; 3. Xian Institute of Dairy & Technology, Xian 710065, China)Abstract: Aim to probe the fermentation properties differences of L. Bulgaricus in cows & goats milk, and explore the proliferation regulations of L. Bulgaricus in the two substrates, and their differences were in a comparative study. The results showed that: after 8h fermented in goats milk the total colony form units reached 2.1109 mL-1; pH 4.160.07; titratable acidity 128.003.61T; and the yield of diacetyls reached （11.720.25）mg/L; the yield of acetaldehydes was （6.090.22）mg/L. While in the same conditions in cows milk the total colony form units reached 1.25109 mL-1; pH 4.450.08; titratable acidity （114.801.31）T; the yield of diacetyls was （11.560.11）mg/L, and the yield of acetaldehydes was （5.120.38）mg/L. Conclusions: there were no signifcant differences between the capacity of producing diacetyls of L. Bulgaricus in cows and goats milk, while the proliferation regulations, acid yield and the yield of acetaldehydes properties of goats milk were superior to cows milk.Key words：Lactobacillus bulgaricus; cows milk; goats milk; fermentation0 引言保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）是常用的复合发酵剂菌株之一，具有多种促健康功效，是发酵食品的益生菌菌株之一1。在酸奶发酵过程中主要作用是产酸、产香，使酸奶具有特殊的风味2。牛乳和羊乳都是乳酸菌生长的良好基质，目前国内外研究主要集中在不同乳酸菌以牛乳为基质的发酵性能评价3-5及酸奶后熟期的酸度变化和香味物质的含量变化等方面6,7。而对在羊乳基质中产酸产香性能研究较少，尤其是同一菌株在不同乳基质中发酵初始期的产酸产香性能差异性相关研究更鲜见报道。本实验以德氏保加利亚乳杆菌为研究对象，以牛、羊乳为基质，通过增菌效率、产酸、产香速率等方面进行发酵差异性评价，为制备乳基质酸奶发酵剂以及优质酸奶制品提供参考。1 实验1.1 材料与设备德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, Lb.）；新鲜山羊乳；新鲜牛乳；脱脂乳粉。MRS培养基、质量分数为0.85%的生理盐水、浓度为0.1mol/L氢氧化钠溶液、质量分数为16%三氯乙酸（TCA）、质量分数为1%邻苯二胺、浓度为4mol/L的HCl溶液、质量分数为1%硫酸铁铵、质量分数为0.02%酚试剂、pH计校准液等均自己配制。SHP-250生化培养箱； PB-10pH计；SW-CJ-2D型净化工作台；BZG30菌落计数器；TOMY ES315自动蒸汽消毒柜；FA2004电子分析天平。紫外-可见分光光度计(UV-1700，SHIMADZU)。1.2 方法1.2.1 样品制备及处理菌种纯培养物母发酵剂生产发酵剂三代活化后，按接种量2%分别接于灭菌的牛、羊乳中，摇匀后分装到预先灭好菌的三角瓶，42发酵。每隔1h牛、羊乳各取出一样品。直接进行梯度稀释和酸度测定，取一定量剩余样品与等体积质量分数为16%的TCA混匀，3500g离心15min，过滤得上清液，用于测定丁二酮和乙醛。1.2.2 pH值的测定 采用0.01级精密数显酸度计测定。1.2.3 滴定酸度oT的测定根据GB5413.34-20108，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定法测定。1.2.4 活菌计数按GB4789.35-20109食品微生物学检验乳酸菌检验部分检测方法进行。1.2.5 丁二酮的测定10 （1）丁二酮测定原理。邻苯二胺可以与联二酮类反应生产2,3-二甲基并吡嗪，生成物的盐酸盐在335nm波长下有吸收，可根据吸光值大小测得丁二酮质量浓度。 （2）丁二酮质量浓度的测定。每样品取一定量与等体积质量分数为16%的TCA混匀，经离心、过滤，得上清液，取出5mL，分别加入0.25mL质量分数为1%的邻苯二胺溶液，摇匀置于黑暗处放于30min，然后加入1.0mL4.0mol/L的HCl溶液，终止反应，混匀后在335nm波长下用石英比色皿测定吸光值。每样做3个平行取平均值。标准曲线制作：鲜羊乳105（10min）灭菌，用于准确配制不同浓度的丁二酮标准液。然后各标准液按照样品处理方法进行操作，测得各标准液的吸光值，以丁二酮质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线如图1所示。 图1 标准曲线-丁二酮质量浓度与吸光值关系1.2.5 乙醛的测定11 （1）测定原理。酚试剂分光光度法测定乙醛质量浓度是根据乙醛与酚试剂C6H4SN(CH3)C:NNH2HCl,3-甲基-2-苯并噻唑腙,NBTH反应生成嗪类物质，该物质在酸性溶液中被高铁离子氧化形成蓝绿色化合物，根据颜色深浅比色定量。 （2）乙醛质量浓度的测定。第1次反应液制备：取5.0mL样品上清液（空白样为5.0mL 8%TCA）和2.5mL质量分数为0.02%酚试剂溶液用水定容至50mL，静止反应30min，得第1反应液。第2次反应液制备：取出5.0mL第1次反应液，加2.0mL质量分数为0.02%酚试剂溶液，0.5mL质量分数为1%硫酸铁铵溶液，（431）条件反应（第2次反应）20min，得第2次反应液。流水冷却，立即在630nm处测定吸光度值，每样品设定3个平行。乙醛标准曲线制作：取1mL乙醛（市售分析纯，体积分数为40%）用8%TCA溶液稀释制备40 mg/L质量浓度的乙醛母液。第1次反应：取5.0mL已知质量浓度的乙醛母液溶液和2.5mL质量分数为0.02%酚试剂溶液，用蒸馏水定容至50mL，静止反应30min；第2次反应：分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL的第1次反应液，以水补足5.0mL，随后按上述实验操作进行，然后630nm处测定吸光值，以质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线如图2所示。图2 标准曲线-乙醛质量浓度与吸光值关系2 结果与讨论2.1 Lb.在牛、羊乳基质中的增菌规律比较 Lb.在牛、羊乳中的增菌规律如图3所示。图3中，二者变化趋势基本一致，随着发酵时间延长活菌数均呈增加趋势，发酵3h后羊乳中的活菌数明显高于牛乳（P0.05），而在发酵3h后差异极显著（P0.01），同时滴定酸度在发酵2h以后差异也极显著（P0.01），最终羊乳pH值降至4.160.07，滴定酸度达（128.003.61）T；牛乳pH降至4.450.08，滴定酸度达（114.801.31）T。表明Lb.在羊乳中的产酸速度比在牛乳中更快。2.3 Lb.在牛、羊乳基质中产香性能的比较2.3.1 发酵过程中丁二酮质量浓度变化及差异性比较 丁二酮是酸奶主要风味物质之一，在发酵过程中牛、羊乳发酵乳丁二酮质量浓度变化如图5所示。由图5可以看出，发酵前6h牛乳发酵乳中丁二酮含量较羊乳发酵乳高，尤其在发酵5h牛乳中丁二酮含量明显高于羊乳，二者差异极显著（P0.05），羊乳中丁二酮质量浓度达（11.720.25）mg/L，牛乳中丁二酮质量浓度达（11.560.11）mg/L。因此，Lb.在牛、羊乳基质中产丁二酮能力接近。图5 牛羊乳发酵过程中丁二酮质量浓度的变化2.3.2 发酵过程中乙醛质量浓度变化及差异性比较 乙醛也是酸奶主要风味物质之一，在酸奶的发酵过程中主要由Lb.产生，以不同乳基质发酵产生乙醛的能力不同，图6表明发酵前期（即4h以内）牛、羊乳发酵乳中乙醛质量浓度差异不显著（P0.05），而48h差异极显著（P0.01），经8h发酵羊乳中乙醛质量浓度明显高于牛乳，最高可达（6.090.22）mg/L，而牛乳中仅为（5.120.38）mg/L。在发酵34h之间羊乳发酵乳中乙醛的质量浓度增加最快，而在48h之间变化不明显，王红叶14研究表明pH值降至5.0时开始产生乙醛，在pH值为5.54.5之间乙醛产生速度加快。本研究中乙醛质量浓度的变化趋势与之相符。Lb.在羊乳中产生乙醛的能力远高于牛乳，原因可能是羊乳中苏氨酸质量浓度高于牛乳13，并且孟祥晨15和邢慧敏6报道乳酸菌产乙醛能力与菌体内苏氨酸醛缩酶有关，在苏氨酸醛缩酶的作用下，苏氨酸可转变成甘氨酸和乙醛，这恰能解释羊乳发酵乳乙醛质量浓度高于牛乳发酵乳的原因。另一方面也可能是羊乳中促生长因子使Lb.繁殖快，从而产乙醛能力强。因此，羊乳比牛乳更合适Lb.产生乙醛，更适合生产具有特殊风味的发酵乳制品。图6 牛羊乳发酵过程中乙醛质量浓度变化3结论（1）以羊乳为基质42发酵8h活菌数最高可达2.10109 mL-1，pH值降至4.160.07，滴定酸度（128.003.61）T，丁二酮质量浓度（11.720.25）mg/L，乙醛质量浓度（6.090.22）mg/L。（2）相同条件下以牛乳为基质活菌数最高可达1.25109 mL-1，pH值降至4.450.08，滴定酸度（114.801.31）T，丁二酮质量浓度（11.560.11）mg/L，乙醛质量浓度（5.120.38）mg/L。（3）Lb.以羊乳为基质42发酵，其增菌效率、产酸及产乙醛能力均优于牛乳基质，差异极显著（P0.05）。（4）相同条件下，Lb.在羊乳中表现出更好的发酵性能。参考文献：1 张和平,张列兵. 现代乳品工业手册M. 北京:中国轻工业出版社,2005.2 BESHKOVA D, SIMOVA E, FRENGOVA G, et al. Production of Flavor Compounds by Yogurt Starter CulturesJ. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，1998(20):180-186.3 PINHEIRO de SOUZA OLIVEIRA R, Casazza A A, Aliakbarian B, et al. Co-metabolism in Skimmed Milk of Streptococcus Thermophilus in Co-cultures with Lactobacillus Bulgaricus or Lactobacillus AcidophilusJ. Journal of Biotechnology，2010, 15:576-587.4 BOTTAZZI V, DELLAGLI F. Acetaldehyde and Diacetyl Production by Streptococcus Thermophilus and Other Lactic StreptococJ. Dairy Res.，2010, 34:109-113.5 甘伯中,杜宁娟,李帆，等.南牧区酸奶中乳酸菌的分离与发酵性能研究J.食品科学，2009, 30(3): 204-208.6 邢慧敏.少数民族自然发酵乳制品中乙醛高产乳酸菌的筛