实验一 固定化酵母酒精发酵.doc

实验一 固定化酵母酒精发酵一、 实验目的掌握淀粉质原料的双酶法糖化工艺。掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。掌握固定化酵母酒精发酵工艺。掌握酒精的提取及测定方法。二、实验原理（一）淀粉质原料的双酶法糖化酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第1步是利用a淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。淀粉质原料双酶法糖化是一新型生产工艺，免去了原料的高温蒸煮，即可节省蒸煮用汽，又可省去冷却用水、电，同时由于酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率（出糖率）高，提高了原料出酒率。（二）微生物细胞的固定化固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。 一般胞内酶、提纯酶在固定化中或固定化后常不稳定，而固定化微生物不仅可避免复杂的酶提取和纯化过程，同时解决了酶的不稳定性问题。细胞固定化后，酶活较高，操作稳定性较好，可在多步酶促反应中应用并便于连续化、自动化操作。若代谢底物及产物均为低分子物质时使用固定化微生物细胞效果更佳。 微生物细胞固定化常用载体有：1、多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K一角叉胶、DEAE-纤维素等）；2、蛋白质（骨胶原、明胶等）；3、无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等 ）；4、合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。选择载体原则以价廉、无毒、强度高为好。微生物细胞固定化常用的方法有三大类： 1吸附法 吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分物理吸附法与离子结合法。（1）物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附住。（2）离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。吸附法优点是：操作简便、载体可再生；缺点是：细胞与载体的结合力弱、pH、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。 2包埋法 是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而废物和产物可以进入和渗出。细胞和载体不起任何结合反应细胞处于最佳生理状态。因此，酶的稳定性高，活力持久，所以目前对于微生物细胞的固定化大多采用包埋法。本次实验作为重点训练。 3共价交联法 是利用双功能或多功能交联剂，使载体和酶或微生物细胞相互交联起来，成为固定化酶或固定化细胞。常用的最有效的交联剂是戊二醛。这是一种双功能的交联剂，在它的分子中，一个功能团与载体交联，另一个功能团与酶或细胞交联。此法最为突出的优点是：固定化酶或细胞稳定性好，共价交联剂和载体都很丰富。然而到目前为止，尚无一种可用于所有种类的微生物细胞固定化的通用方法，因此，对某一待定的微生物细胞来说。必须选择其合适的固定化方法和条件。三、实验材料1、菌种：酿酒酵母。2、培养基（1）种子培养基YEPD酵母膏 10g 葡萄糖 20g蛋白胨 20g 自来水 1000mlpH 5.5分装100ml培养基于300ml锥形瓶中，经0.1MPa灭菌20min。（2）酒精发酵培养基使用玉米淀粉水解液培养基。将酶解法制备的玉米淀粉水解液在每个500ml锥形瓶中分装300ml，0.1MPa灭菌20min备用。3、主要药品玉米粉、耐高温a淀粉酶、糖化酶、硫酸、pH试纸、海藻酸钠、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、生理盐水、CaCl2等。4、器皿及仪器恒温水浴锅、培养箱、粉碎机、电炉 、高压灭菌锅、显微镜、糖度计、量筒、纱布、500ml三角瓶、100ml烧杯、500ml烧杯、1000ml烧杯、培养皿、无菌10ml注射器外套及5静脉针头、移液管、玻璃棒、冷凝管等。四、实验步骤 （一）玉米淀粉水解液的制备玉米粉250g，加水1000ml搅拌均匀，加耐高温a淀粉酶100ug玉米粉，加热至8590，液化45min左右，间歇取水解液进行碘反应实验，若无蓝红色产生，仍然是碘和醪的原色时，则表示淀粉已完全水解为糊精等小分子产物。液化反应一般以碘反应颜色正好消失时为终点。然后冷却至60，用硫酸调pH在4.04.5，加糖化酶300ug玉米粉，保温糖化30min，不断搅拌。糖化结束，用2层纱布滤去残渣后用糖度计测滤液的糖度，调糖度15Bx左右，调pH4.7，将玉米淀粉水解液分装入500ml三角瓶，0.1MPa灭菌20min备用。1、酵母种子液的制备挑取新鲜斜面菌种几环，接入装有100mlYEPD培养基的锥形瓶中，30振荡培养，培养30h。2、海藻酸钠凝胶固定化酵母细胞的制备海藻酸钠凝胶是从海藻中提取获得的藻酸盐，为D甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子如Ca2、Al3可诱导凝胶形成。将微生物细胞与海藻酸钠溶液混匀后，通过注射器针头或相似的滴注器将上述混合液滴入CaCl2溶液中，Ca2从外部扩散进入海藻酸钠与细胞混合液珠内，使藻酸钠转变为水不溶的藻酸钙凝胶，由此将微生物细胞包埋在其中。在此法的使用中，应尽量避免培养基中含有钙螯合剂（如磷酸根），因为它可导致钙的溶解和释放，并由此引起凝胶的破坏。称取0.8g海藻酸钠于100ml烧杯中，加去离子水少许，调成糊状，再加入其余的水（总量为20ml）。火上加温至熔化，0.1MPa灭菌20min，冷却至45左右，加入4ml酵母培养液，混合均匀，倒入一个无菌的小塑料瓶中或注射器外套并与5静脉针头相连，通过1.52.0mm的小孔，以恒定的速度滴到100ml无菌烧杯中，杯中预先盛有50ml含10葡萄糖的已灭菌的10CaCl2（胶诱导剂）溶液，使形成凝胶珠。浸泡30min后，将凝胶珠转入无菌烧杯中，用无菌去离子水洗涤三次，然后接种入300ml酒精发酵培养基中，置25下发酵7天，测定酒精含量。另外，再取10ml未经固定化的酵母种子液投入到装有300ml酒精发酵培养基中作为对照，同样条件下发酵7天后测酒精含量。（三）酒精发酵液的蒸馏及酒精度的测定取100ml发酵液，倒入500ml圆底烧瓶中，加100ml蒸馏水蒸馏，当开始流出液体时，用100ml量筒接收馏出液100ml，并用酒精比重计测量其酒精度。剩余的发酵液全部倒出后弃去，将固定化细胞用无菌去离子水洗3次，