第五章 化学酶工程.docx

第五章 化学酶工程第一节 酶分子的化学修饰 第二节 抗体酶 第三节 印迹酶第一节 酶分子的化学修饰一 酶的化学修饰原因1 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。（热、蛋白）2 作用的最适条件不符。（半衰期延长，最适PH扩大）3 酶的主要动力学性质的不适应。（Km增大，结合差）4 临床应用的特殊要求。 (异源蛋白-抗原-抗体-降低酶类药物抗原性）二 酶修饰的方向1 核酸水平2 蛋白质水平（化学修饰）三 酶化学修饰的基本原理（解决4个“ ？”）1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2 如何保护酶活性部位与抗抑制剂3 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境酶化学修饰的定义：（二） 酶化学修饰的方法及修饰剂 一 修饰剂的要求二 酶性质的了解三 反应条件的选择四 酶修饰方法一 修饰剂的要求1 修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋 白质的吸附性。2 修饰剂上反应基团的数目及位置。3 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。二 酶性质的了解1 酶活性部位情况2 酶的稳定条件、酶反应最适条件3 酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼 性等。三 反应条件的选择1 反应体系中酶与修饰剂的分子比例。2 反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。3 反应温度及时间。四 酶修饰方法1 酶分子侧链基团的化学修饰 2 有机大分子对酶的化学修饰3 蛋白质类及其他。1. 酶分子侧链基团的化学修饰 一几种重要的修饰反应二特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰三. 研究新热点一几种重要的修饰反应1酰化及其相关反应2烷基化反应 3氧化和还原反应 4芳香环取代反应 二特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1巯基的化学修饰 常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺2氨基的化学修饰 3羧基的化学修饰 4咪唑基的化学修饰 5胍（gua）基的化学修饰 三. 研究热点-核酸类酶的修饰 RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。主要是核糖2-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。方法：核苷酸置换修饰 2-位置上的羟基去除 在残基上接上氨基酸等有机化合物2. 有机大分子对酶的修饰一. 概念利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。 二常使用的水溶性大分子修饰剂 糖及糖的衍生物高分子化合物具有生物活性的大分子物质3. 蛋白质类及其它一蛋白质类修饰二金属离子置换修饰一蛋白质类修饰什么蛋白质具有优越性？血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较多！常用方法1戊二醛法：戊二醛双功能基团 2碳二亚胺法：碳二亚胺作为交联剂 3活性酯法：3活性酯法（1）原理：根据多肽合成原理发展起来 （2）特点：反应条件温和，避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触所可能产生的酶失活，减少了副反应的产生。（3）工艺步骤：a 白蛋白琥珀酰化 b 活性酯形成反应 c 修饰反应 二金属离子置换修饰1 概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。2常用离子常用二价金属离子。金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶 举例将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。 （三） 修饰酶的性质及特点一热稳定性二抗原性三体内半衰期四最适pH五酶学性质的改变六对组织的分布能力变化一热稳定性例：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可使该酶的活力提高到原有酶活力的2.25倍。原因：1修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的结构刚性。2减少了酶分子内部基团的热振动。热稳定性举例：例：过氧化氢酶：右旋糖酐：50/10min，40%-90% 溶菌酶：右旋糖酐：100/30min，20%-90% 糜蛋白酶：右旋糖酐：37/6h，0%-70% 糜蛋白酶：肝素：37/6h，0%-80% 尿酸酶：人血清白蛋白： 37/48h，50%-95%二抗原性三体内半衰期体内半衰期延长 四最适pH有些酶经过化学修饰后，最适pH发生变化例如：猪肝尿酸酶的最适pH为10.5，在pH7.4生理环境时5%-10%，但用白蛋白修饰后， 可保留60%吲哚-3-链烷羟化酶修饰后，最适pH从3.5变到5.5，在pH为7时，修饰酶活比天然酶增加3倍。五酶学性质的改变绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。六对组织的分布能力变化对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。六对组织的分布能力变化举例a-葡萄糖苷酶在体内希望尽量避免受到吞噬细胞的破坏，利用白蛋白修饰后肝溶酶体摄入量达35%，吞噬细胞3%辣根过氧化物酶用聚赖氨酸修饰后，穿透细胞的能力增强从0.2%-15.9%天然溶菌酶几乎不被肝细胞吸收，用唾液酸糖肽修饰溶菌酶后每分钟肝摄入量3.2%-34%。 （四） 酶化学修饰的应用 一化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 应用1 研究酶的空间结构研究酶分子的解离-缔合现象。推算出酶分子大小、形态及构象变化。测定氨基酸残基在酶分子中存在的状态。利用双功能试剂交联修饰可以测定酶分子中特定基团的距离应用2 确定氨基酸残基的功能3 测定酶分子中某种氨基酸的数量 测定酶的氨基酸序列和研究变构酶时，也是以化学修饰为基础。二 化学修饰酶在医药和生物技术中的应用例：精氨酸酶具有抗癌作用，它用PEG 修饰后，修饰率为53%时，酶活力保持65%。与抗体结合能力和诱导产生新抗体的能力均消失，在血液中停留时间延长，显著地延长了移植肝癌后的小鼠生命。例：辣根过氧化物酶用MPEG共价修饰后，在极端pH 条件下抗变性能提高，耐热性也有所加强。三 蛋白质化学修饰的局限性化学修饰专一性相对酶的构象有些变化只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行研究酶结构与功能缺乏准确性和系统性第二节 抗体酶抗体酶概念抗体酶产生的理论基础抗体酶的制备方法抗体酶的应用抗 体由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。抗体的最显著的特征是：多样性和专一性酶是生物催化剂酶是一类具有催化功能的生物分子 酶反应有两个主要的特征：高催化效率、高选择性1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催化的实质酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。过渡态理论过渡态理论与反应过渡状态结合作用在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。抗体酶设想1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度特异性，与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性，在过渡态理论的基础上首先提出设想：能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能具有酶的活性，催化反应的进行。1986年Lerner和Schultz证实了这一设想。抗体酶的发现Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。1986年美国Lerner和Schultz两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化抗体，即抗体酶。抗体酶抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalytic antibody)一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。抗体酶具有典型的酶反应特性与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。 过渡态理论与抗体酶如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥催化作用。实际所采用的过渡态抗原知识推测而设计的过渡态类似物。用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应并非该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。抗体酶的特性1、能催化一些天然酶不能催化的反应有许多化学反应还没有已知酶催化进行抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性抗体酶可以根据需要人工裁制抗体酶的催化反应类型1、转酰基反应2、水解反应3、Claisen重排反应4、酰胺合成反应5 Diels-Alder反应6、转酯反应7、光诱导反应8、氧化还原反应9、脱羧反应10、顺反异构化反应 抗体酶的特性2、有更强的专一性和稳定性抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性较高。抗体酶的制备将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。诱导法设计半抗原选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物q 用设计好的半抗原，与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原；将此抗原进行免疫，使宿主针对抗原产生抗体。q 产生抗体的脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到的杂交瘤细胞既能产生抗体又能在体外培养；q 将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一均匀的抗体。利用过渡态类似物制备抗体酶示意图诱导法动物免疫技术和杂交瘤技术有机结合而产生的一种新方法。利用这种方法所得到的抗体酶催化效果的好坏很大程度上取决于化学模型物的设计。反应过渡态类似物，即半抗原的设计。抗体酶用于有机酯的水解，过渡态类似物磷酸盐和磷酸酯作为免疫原诱导产生的单克隆抗体催化水解反应比未催化反应快104倍。拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。独特型每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志独特型是单克隆的，其抗原决定簇位于V区同一个体中不同B细胞克隆所产生的Ig可变区所具有的抗原特异性标志，由Ig超变区特有的氨基酸序列和构型所决定。独特型可由多个抗原决定簇组成，这些决定簇称为独特位。抗独特型抗体Ab2抗Ab1V区骨架部分，具有封闭相应BCR或Ig分子的抗原结合点，抑制相应B细胞克隆的活化Ab2抗Ab1V区CDR部分，具有类似相应抗原的分子构象，可模拟抗原与相应B细胞克隆受体结合并使之激活，故称为抗原的内影像 抗独特型抗体酶根据Jeme提出的免疫网络学说，抗独特型抗体中的Ab2能识别并结合Ab1上与抗原表位结合的补位，其具有抗原内影像作用，可在空间结构上模拟抗原并可能具有抗原的一些性质。根据这一理论，可以酶作为免疫原诱导机体产生抗体，再利用该抗体继续免疫，诱导产生的抗独特型抗体即可能具有催化活性。利用该方法的优点是可直接利用酶诱导机体产生抗体，进而产生与酶具有相同活性部位的抗独特型抗体;如果对酶的结构预先进行修饰，还有望诱导产生底物特异性与酶不同的催化性抗体。引入法用基因工程方法改造和制备全新的抗体酶是一种很有前途和发展潜力的抗体酶制备方法。将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，也可以针对性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列，以获得高效的抗体酶。对于已产生的单抗，分析抗体结合部位的氨基酸顺序或对应的碱基顺序。然后通过对抗体酶结合部位氨基酸对应的基因序列进行定点突变，希望能在抗体结合部位换上有催化作用的氨基酸。进而改变抗体酶的催化效率。随着噬菌体抗体库技术的完善，可根据需要构建适当序列的基因片断，绕过免疫学方法，构建全新的抗体酶。噬菌体展示技术将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因库和抗体在大肠杆菌中功能性表达，与高效快速的筛选手段结合起来，彻底改变了抗体酶生产的传统途径。用工程抗体催化法生产抗体酶，不需要进行细胞融合以获得杂交瘤细胞，并且可筛选具有特定功能的未知结构，具有生产简单、价格低、抗体的免疫原性较低的优点，并易获得稀有的抗体。Fab片断由轻链和重链的VH及CH1部分组成，作为一种催化剂，抗体酶有这样的片断就行，无须完整的抗体分子。从人或动物的抗原中抽取基因，然后用PCR技术重新铸造轻链和重链，这样就可以把这些基因组合成100万个含有成对轻链和重链的基因库。这些基因库是存储在细菌病毒里，通过随机地将基因和轻重链结合的方法，就可大量制造Fab片断了。这就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体。 化学修饰法抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。抗体酶的应用前景1、 抗体酶在帮助戒毒方面的应用 Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的 。抗体酶用于肿瘤治疗目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。前药 ( prodrug)是指由具有生物活性的药