基因工程实验.doc

实验一 从植物中提取DNA【实验目的】 1、掌握提取DNA的技术及原理 2、学习DNA提取的方法 【实验原理】 首先研磨粉碎的植物组织在LP缓冲液裂解完全，基因组DNA被释放出来。在加入DA缓冲液沉淀后，去除大部分杂质。然后，由于加入的P Binding缓冲液中适当的盐分及pH值得作用下，DNA被特异吸附于Biospin膜上。通过洗涤，可将蛋白质等残留的杂质去除。最后使用Elution Buffer将DNA从膜上洗脱下来，从而获得基因组DNA。【实验材料】 自己采取某种植物的叶子1. 实验试剂 植物DNA提取试剂盒【实验操作】 1. 剪取约0.2-0.5g叶片于冷研钵后，迅速倒入液氮用玻棒研磨成为粉末，分装到1.5ml的离心管中。2. 加入450l LP缓冲液，并混合均匀。3. 于65环境下温浴15分钟，温浴中可间或震荡离心管2-3次，然后移出。4. 加入150lDA缓冲液，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。5. 将混合物全部转移至Shredder spin colum，于离心机中3分钟。6. 将滤液转移至一个新的1.5ml离心管。7. 加750l P Binding缓冲液，并混合均匀。8. 将混合液转移至Spin column。于离心机离心1分钟，弃去接液管中的液体。9. 向Spin column中加入500l的G Binding Buffer。离心30秒，弃去接液管中液体。10. 向Spin column中加入600l的Wash Buffer。离心30秒，弃去接液管中液体。11. 重复步骤10一次。12. 再次将Spin column离心1分钟，并将Spin column 转移至一个新的1.5ml离心管中。13. 向Spin column中加入100l的 Elution Buffer，并于室温温育1分钟。离心1分钟，取离心管中的液体含有DNA。实验二 PCR扩增 DNA【实验目的】 1、掌握 PCR扩增 DNA的技术及原理 2、学习 PCR扩增仪的使用 【实验原理】 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）是一种体外 DNA扩增技术，1985年由 Mullis 等人创立。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段 DNA 扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。 PCR 的工作原理类似于 DNA 的体内复制过程，是将待扩增的 DNA 片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的 DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板 DNA 互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板 DNA、一对引物、dNTP、耐高温的 DNA 聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板 DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的 DNA 序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的 DNA 聚合酶作用下，以变性的单链 DNA 为模板，从引物 3端开始按 53 方向合成 DNA 链。这样经过一个周期的变性复性延伸等三步反应就可以产生倍增的 DNA， 假设 PCR的效率为 100%,反复 n周期后，理论上就能扩增 2n 倍。PCR反应一般 30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。 常规 PCR反应用于已知 DNA序列的扩增，变性温度为 95，复性温度为 3755，延伸合成温度为 72，DNA聚合酶为 Taq酶（可耐受 95左右的高温而不失活），反应循环数为 30。 【实验材料】 1. 实验器材 PCR 扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪。 2.实验试剂 （1） 模板 DNA （0.1g/l）： 用牙签挑取单菌落悬浮到 50l的裂解液中 （裂解液1%TritonX-100，20m mol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA）, 95 温浴 10分钟, 10000rpm离心 5分钟,取 2l上清液用于总体积 50l 的 PCR反应。 （2）TaqDNA聚合酶（5U/l），10扩增缓冲液，dNTP （1mmol/L）：购买 （3）引物（100pmol/L）：设计并合成与目的 DNA两侧互补的引物内。 【实验操作】 1准备 PCR反应溶液 （1） 按以下次序，将下列成分在 0.5ml 灭菌 Eppendorf管内混合： 10扩增缓冲液 10l 4dNTPs(包括四种 dNTP) 8l 引物 1 1l 引物 2 1l 模板 DNA 1l (10ng) Taq DNA聚合酶 1l (2.5U) 加水至终体积 100l （2） 用手指轻弹 Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心 2秒以集中溶液于管底。 （3）加石蜡油 50l封住溶液表面。 2PCR扩增反应 将加好样品的 Eppendorf管置于 PCR扩增仪内，95 5 分钟，使模板 DNA完全变性。然后按 95变性 1分钟，55退火 45秒，72延伸 1分钟，重复循环 30次，循环结束后 72延伸 8分钟。反应完毕，将样品取出置-4待用。 【实验结果】 取出样品，进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳，溴化乙锭(EB)染色，观察 DNA 条带。具体操作方法见实验(6)。 【讨论】 1PCR 结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火温度和时间，调整 Mg2+ 浓度等。 2PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和 dNTP的量不宜过多。 3引物设计要合理。一般引物长度为 18个30个核苷酸；引物间的 G + C含量应为 40%60%，而且避免引物内部产生二级结构；引物 3端不应该互补，避免在 PCR 反应过程中产生引物二聚体；避免引物 3端出现 3个连续的 G或 C；理想的情况下，成对引物的 G、C含量应相似以便以相近的退火温度与互补的模板链相结合，此外，引物 5端序列对于后续操作也是十分有用的，例如，对 PCR 产物进行克隆时，可以考虑在引物 5端引入限制性酶切位点。 【思考题】影响 PCR的因素有哪些？ 实验三 琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA 【实验目的】通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA的原理与方法。 【实验原理】 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由 D型和 L型半乳糖以 -1，3和 -1，4糖苷键相连形成的线状高聚物（如下图所示）。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从 50nm 到大于 200nm的凝胶。 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化 DNA 片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收 DNA 谱带。 琼脂糖凝胶的分离范围较广，选择不同凝胶浓度和装置，从 50个碱基对到几兆不同长度的 DNA都可以实现分离。使用电场强度和电泳方向恒定的水平板琼脂糖凝胶电泳的方法，可以很好的分离长度在50-20,000 bp 的 DNA片段。 DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。例如 DNA分子的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大小的线性 DNA片段,在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后，凝胶中的 DNA 可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到 20pg的双链 DNA。 【实验材料】 1. 实验器材 水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55水浴；沸水浴；微量移液器 2.实验试剂 （1）DNA样品；DNA标准分子量标记物；琼脂糖；1x电泳缓冲液 TBE；6x样品缓冲液 （2）溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。将配好的 10 mg/ml 溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至 0.5g/ml。 缓冲溶液配制表 缓冲溶液 工作溶液 储存溶液（每升） TBE 0.5x 5x 0.045mol/L Tris-硼酸 54 g Tris 碱 0.001mol/L EDTA 27.5g 硼酸 20ml0.5mol/L EDTA (pH8.0) 6x样品缓冲液 0.2% 溴酚蓝 储存温度 4 50% (w/v) 蔗糖水液 【实验操作】 1. 照厂家说明准备好灌胶模具，置于水平面上（实验操作示意图如下）。 2. 配制 1%琼脂糖凝胶。取 250ml 三角瓶，加入 100ml TBE 缓冲液，称取 1克琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在 55水浴中保温。在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度 35mm，避免气泡产生。 3. 室温放置 3045 分钟，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水平板电泳槽。4. 在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面 1mm，拔下梳齿形成样品池。5. 取样品与 6X样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样品池中。 6. 盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压 15V/cm （按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端 1cm时，切断电源。 7.