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细胞分子生物学讲义扬州大学兽医学院二九年九月第一章 细胞与生物大分子一、 细胞的分类1、原核细胞（prokaryotic cell）：没有细胞核。主要包括真细菌、古细菌。 古细菌长生活于极端环境中，如厌氧、嗜盐、嗜热。2、真核细胞（eukaryotic cell）： 有细胞核。主要包括原生生物、真菌、动物和植物。二、细胞的基本组成细胞质：是细胞的粘性成分，包括蛋白质、核糖体、代谢物和离子。其中，核糖体是蛋白质加工的场所。 质膜：是细胞质周围的膜结构，由磷脂双分子层结构。磷脂双分子结构也是其他生物膜的基本组成形式。 DNA：是遗传物质。真核细胞具有多个DNA分子，位于细胞核和线粒体上；原核细胞只有一个DNA分子，并且核区和细胞质间没有特定的界限。（一）原核细胞结构1、细胞壁：防止细胞在低渗环境中裂解2、质膜：磷脂双分子层，膜上蛋白质可以允许小分子出入3、遗传物质：类核（单链、环状）、质粒4、核糖体：蛋白质加工的场所5、纤毛：黏附、性别6、鞭毛：细胞移动（二）真核细胞结构1、细胞核：DNA转录和RNA加工的场所2、线粒体：细胞呼吸即营养物质氧化以ATP形式产生能量的场所3、叶绿体：光合作用4、内质网：滑面内质网、粗面内质网5、微体：溶酶体、过氧化物酶体、醛氧化酶体（三）细胞器的分离 1、细胞破碎（低渗休克、机械剪切、非离子去垢剂处理等）2、离心分离细胞器（差速离心、密度梯度离心等）3、纯度鉴定（电镜观察、细胞器特异酶活性测定）三、细胞分化 一个真核细胞分裂产生的子代细胞既可以完全相同，也可以通过改变基因表达的格局，形成功能不同于母代细胞的子代细胞，这一过程称为细胞分化。对于原核细胞和低等真核细胞来说，孢子化是典型的细胞分化。对于复杂的多细胞生物而言，胚胎细胞的分化能形成肌肉细胞、神经细胞、肝细胞和肾细胞等高度特定化的细胞。细胞的分化由发育控制基因负责调节。多细胞生物不同组织和器官活动的相互协调，主要通过信息分子之间的信息交流来控制。四、生物大分子1、蛋白质蛋白质是氨基酸的聚合体，由不同的氨基酸通过肽键连接而成。蛋白质具有结构和功能上的重要性，其结构和特点将在以后章节中叙述2、 核酸核酸（nucleic acid）是核苷酸的聚合体，包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。核苷酸（nucleotide）又由碱基、五碳糖（或称戊糖）和磷酸组成。核酸负责遗传物质的储存与加工，但信息的表达需要蛋白质的合成。3、多糖是共价糖苷键相连的单糖聚合体，主要作为糖的储存形式和细胞的结构成分。纤维素和淀粉都是葡萄糖的聚合体，前者是以-1、4糖苷键相连的线性聚合体，为植物细胞壁的主要结构成分，后者是葡萄糖的储存形式，存在于较大的细胞颗粒中，这些颗粒能被很快降解，以便释放代谢所需的能量。糖原是真菌和动物细胞的 葡萄糖储存形式。几丁质(壳多糖)存在于真菌细胞壁和昆虫、甲壳纲的外壳中，结构与纤维素相似，单体是N-乙酰葡糖胺。粘多糖高度粘稠，其溶液呈胶冻状。4、脂类脂类分子的本质是碳氢化合物，水中可溶性差，参与能量的储存与运输，是胞浆膜、保护性外壳和其它细胞结构的组分甘油酯：甘油分子酯化的长链脂肪酸。 动物甘油三脂的脂肪链是线性的，分子可以紧密包裹，形成固体的脂肪；植物油含有一个或多个双键的不饱和脂肪酸，折转（带有一定角度）的链状结构阻碍了分子的紧密包裹，所以在室温下表现为液体。磷脂：两个脂肪酸和一个磷酸分子相连的甘油组成。鞘脂：长链氨乙醇鞘氨醇含有一个与酰胺键相连的脂肪酸。鞘磷脂：神经酰胺与磷酸胆碱连接成。5、 复杂大分子由一种以上生物分子以共价键或非共价键连接而成的，结构和功能更复杂多样的生物大分子。核蛋白：核酸+蛋白糖蛋白：蛋白+糖蛋白聚糖：蛋白质+粘多糖脂联蛋白、脂蛋白、糖脂等五、生物大分子的装配1、蛋白质复合体 如细胞骨架，负责细胞形态的维持、细胞的运动和细胞器在细胞内的分布，由微丝、微管和中间纤维等组成。微丝主要结构成分是肌动蛋白，后者与肌球蛋白形成的收缩性装配与细胞浆的泳动有关；微管是由细长的微管蛋白（110kDa球状蛋白）聚合而成的聚合体，组成细胞骨架的中间微丝含有角蛋白等多种蛋白质，具有加强细胞结构等功能。2、核蛋白 由核酸和蛋白质共同组成。核糖体：胞浆内较大的核糖核蛋白复合体，也是蛋白质合成的部位。 大肠杆菌的70S核糖体由50S和30S两个亚单位组成，前者包括1个23S RNA、1个5S RNA和31个不同的蛋白质分子，后者含有1个16S RNA分子和21个蛋白质分子。核小体：染色质的基本结构单位，包括200bp左右的DNA、一个组蛋白八聚体及一个分子的组蛋白H1。3、胞浆膜 在水相环境中，磷脂和鞘脂能自然形成所谓的脂质双层，其外侧为极性基团，内部为非极性烃链，是所有生物膜的结构基础。蛋白质也是细胞膜的主要成分 -外周膜蛋白：松散地结合在胞浆膜的外表 -整合型膜蛋白：嵌镶在细胞膜内 -跨膜蛋白横：横跨整个细胞膜，具有疏水性跨膜氨基酸区域膜蛋白主要功能：受体作用；酶作用，降解细胞外分子；选择性运输的孔道；细胞间相互作用的介质 。4、非共价结合 1）盐桥作用：生理pH下，离子化基团之间能通过相反电荷的相互吸引结合。如带负电荷的DNA磷酸基与带正电荷的DNA结合蛋白（如组蛋白）的结合。2）极性之间的作用：电荷不对称分布，导致偶极分子之间以电荷-偶极和偶极-偶极的方式相互作用，但其结合力较弱。不带电荷的基团，由于其电子的运动可以产生瞬时的偶极，也可以发生弱的结合。3）范德瓦耳斯力（Wander Waals force）：电中性分子之间的非共价结合，氢键起重要作用。4）疏水作用：非极性分子在水相环境中。第二章 蛋白质结构一、氨基酸蛋白质是L-氨基酸的聚合物。除了脯氨酸外，蛋白质中已发现的所有氨基酸都有一个共同的结构，即与一个羧基相连的-碳原子、一个氨基、一个质子和一个随氨基酸不同而异的侧链。除了甘氨酸外，所有的-碳原子均具有手性少数蛋白质含有所谓的非标准氨基酸，后者通过转译后修饰形成，如胶原中的4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。根据侧链的不同对氨基酸进行分类1、带电荷的侧链： 酸性氨基酸：通常带有离子化外的额外的羧基（带负电荷），如天冬氨酸、谷氨酸。 碱性氨基酸：带有正电的基团，如赖氨酸有亚氨基连接在-碳原子上，精氨酸则有一个胍基。 酸性和碱性氨基酸可以组成蛋白质中重要的盐桥。2、不带电的极性侧链 不带电的极性侧链氨基酸含有可与水形成氢键的基团，如丝氨酸、苏氨酸。 与带电氨基酸一起，常被称为亲水氨基酸。3、非极性脂肪烃侧链如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等4、芳香族侧链如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸二、蛋白质结构1、形状 球形蛋白质（球蛋白）紧密折叠，在溶液中呈近似球状颗粒。自然界中绝大部分的酶是球形蛋白。 丝状蛋白质丝状蛋白呈高轴比（长/宽），是重要的结构蛋白。例如头发与羊毛中的丝蛋白和角蛋白。2、大小蛋白质的分子量几千道尔顿（如胰岛素有51个氨基酸，约5734Da）到几百万道尔顿（如丙酮酸脱氢酶至少有500万道尔顿）。某些蛋白质还含有非蛋白成分，包括脂类、碳水化合物或某些共因子等3、一级结构从N端到C端的氨基酸顺序就是多肽的一级结构。4、二级结构螺旋（多肽链骨架形成右手螺旋） 每周3. 6个氨基酸 每个肽的N-H基团都与相距3个残基的C=O基团间形成氢键，N-HO=C 常见于球形蛋白中，有时也见于纤维状蛋白中折叠（-sheet） 是由蛋白多肽链的氨基及羧基与其它区域的互补基团以氢键结合而形成，通过两条或多条相邻链之间的氢键得以稳定，多个链通过氢键结合成折叠片。5、三级结构不同片段-螺旋、-折叠、其他微二级结构和连接环进一步折叠成三维构象即多肽的三级结构。折叠带有亲水侧链的氨基酸主要位于蛋白质外部，可与水或溶剂离子反应，而疏水氨基酸被埋在疏水的内部，这使得结构总体上稳定。三级结构的特性存在于一级结构之中，给予合适的条件，绝大多数多肽将自发折叠成正确的三级结构，因为那通常是序列能量最低的构象。多肽在体内的正确折叠，常常需要伴侣蛋白的帮助，它能够在蛋白质合成（一级结构）结束前阻止新生多肽的错误折叠。维系三级结构的作用力有： 非共价作用：范德华力、氢键、带相反电荷之间静电盐桥、存在于芳香族和脂肪族氨基酸非极性侧链间的疏水相互作用。 共价作用：二硫键加热以及极端pH可以破坏二级和三级结构，导致蛋白质的变性，形成无规卷曲。6、四级结构稳定三级结构的力同样可维系亚基在一起，包括不同多肽链的半胱氨酸间的二硫键。这一组织水平称为四级结构。 构成很大的蛋白分子，如微管蛋白（、亚单位组成的二聚体） 通过复合不同活性于一个整体，赋予一个蛋白以更多功能，如脂肪酸合成酶复合体 亚基间的相互作用通过与一些小分子的结合而被修饰，导致酶调节中别构效应的发生。三、蛋白质功能分类1、酶：除了少数有催化活性的RNA分子外，几乎所有的酶都是蛋白质。2、信号传递：细胞膜上的受体蛋白与来自细胞外介质的配体（如激素）结合，通过最终的构象，在细胞内启动对应于配体的反应。3、转运与贮存：血红蛋白在红细胞中转运氧气，转铁蛋白转运铁至肝脏。4、结构与运动：胶原蛋白是皮肤、骨骼和结缔组织中主要的蛋白质，头发主要由角蛋白组成。5、营养：酪蛋白和卵清蛋白分别是奶和蛋中主要的蛋白质，为发育中的后代提供氨基酸。6、免疫：识别并结合细菌、病毒和其他外源物质（抗原）的抗体，也是蛋白质。7、调节：转录因子与DNA结合并调节其功能。四、蛋白质结构域、基序和家族1、蛋白质的结构域 许多蛋白质含有相互独立的结构单元即结构域（domain），由同一肽链内具有有限高级结构的区域连接而成，往往与特定的功能有关，故又称为功能区。对于真核蛋白来说，结构域往往由特定的外显子编码2、结构基序（motif），又称超二级结构 频繁出现在球蛋白中的二级结构元件群，在功能上很重要，代表着同祖先蛋白质家族进化过程中保留下来的保守的结合位点或催化位点的必要部分 不同的蛋白质可能含有相同的结构基序，因此可能具有相同或相近的功能3、蛋白质家族 蛋白质家族起源于一个古老基因的连续复制和随后的趋异进化。 不同物种的具有相同功能，承担相同生化角色的蛋白质家族成员（如大鼠和小鼠的肌红蛋白）为直向同源。 进化不同但功能类似的蛋白（如-球蛋白与-球蛋白） 不同生物体的一个蛋白质家族成员间氨基酸序列的相似程度取决于两个生物体从共同祖先偏离的时间以及该序列的保守性对蛋白质功能的重要性。 在分子生物学研究中，反映不同生物（包括微生物和动物）进化关系的进化树就是根据上述原理建立的。五、蛋白质分析法1、纯化（Purification）: to obtain enough pure sample for study根据蛋白质性质来选择蛋白纯化方法的原则：分子大小：凝胶过滤层析、超速离心电荷：离子交换色谱、等电聚焦、电泳疏水性：疏水相互作用层析亲和性:亲和层析重组技术:通过DNA操作，使得蛋白纯化变得简单2、序列测定（Sequencing）: determine the primary structure of a pure protein sample蛋白质的序列测定：盐酸（6M，110，24小时）能水解氨基酸之间的肽键，水解产物经层析法分析后可以获得蛋白质的氨基酸组成等信息，但不能反映氨基酸的顺序排列。氨基酸序列的测定常用特定的水解酶（如胰酶和V8蛋白酶）或化学物质（如溴化氰）将蛋白质水解成若干个小片段，然后用自动蛋白序列测定仪和顺序Edman降解法逐一进行序列测定，此方法的缺点是难度较大和成本较高，准确率也有待改进。目前大多数蛋白质的序列分析是先测定其编码基因的DNA序列，然后根据遗传密码规则，借助电子计算机软件推导出相应的氨基酸序列,此方法较为简单和快速，但不能反映蛋白质的转译后修饰。3、分子量测定（Mass determination）: determine the molecular weight (MW) of an interested protein. 蛋白质的分子量测定 凝胶过滤层析法:是蛋白质分子量测定的常用方法之一，以已知分子量的标准蛋白为对照，在相同条件下进行凝胶过滤，根据洗脱时间推算出未知蛋白的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS-PAGE）:也是测定多肽链大小的方法之一，其原理是与SDS（十二烷基硫酸钠）的离子化硫酸基结合后，所有蛋白质均带负电荷，在电场中向阳极移动，但迁移速度取决于分子量的大小。质量光谱测定:是极为准确的蛋白质分子量测定方法，缺点是只能测定几千道尔顿（kDa）以下的蛋白质，而且对分析蛋白的破坏性很大电喷射离子化测定:是近年来出现的一种较为缓和的蛋白质分子量测定方法，其测定上限较质量光谱测定高得多基质促进激光解吸/离子化测定4、X-ray crystallography and NMR: determine the tertiary structure of a given sample.第三章 核酸一、核酸结构核酸包括脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）两大类，其基本组成单位为核苷酸。1、碱基 DNA和RNA中的碱基包括嘌呤和嘧啶,嘌呤为融合的双环结构，包括腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）；嘧啶为单环结构，包括胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T）。DNA中的四种碱基分别为A、T、G和C，而RNA中的T被结构非常相似的U取代，两者的唯一区别是T的第五位上有个甲基。 稀有碱基(unusualcomponent) 核酸分子中的上述五种碱基环上的某一位置被一些化学基团（如甲基化、甲硫基化等）修饰后的衍生物，约有数十种之多。 一般这些碱基在核酸中的含量稀少，在各种类型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修饰碱基主要见于噬菌体DNA，RNA中以tRNA含修饰碱基最多。2、核苷 碱基与戊糖环的1-位碳原子以共价糖苷键相连，形成的产物称为核糖核苷（简称核苷）。RNA中的戊糖为核糖，而DNA中的戊糖为2-脱氧核糖，即2-位羟基被氢原子取代。核糖与碱基连接而成的核苷分别称为腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷，而脱氧核糖与碱基连接而成的核苷分别称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷。3、核苷酸 核苷与一个或多个磷酸基以共价键连接成为核苷酸，如果戊糖为脱氧核糖，连接产物则称为脱氧核苷酸，就其化学本质而言，上述连接产物为磷酸酯二、DNA双螺旋结构DNA二级结构1、DNA双螺旋结构1956年James Watson和Francis Crick提出DNA双螺旋结构获得美国当年百项科学奖头奖。双螺旋模型的主要特征： 两条链反向平行 两条链上的碱基互补配对并以氢键相连 两条链形成右手螺旋 双螺旋表面有大沟和小沟相邻碱基对平面之间的距离为0.34nm，即顺中心轴方向，每隔0.34nm有一个核苷酸，以3.4nm为一个结构重复周期。核苷酸的磷酸基与脱氧核糖在外侧，通过磷酸二酯键相连接而构成DNA分子的骨架。脱氧核糖环平面与纵轴大致平行。双螺旋的直径为2.0nm。2、DNA双螺旋类型A-DNAB-DNAC-DNAD-DNAZ-DNA一般说来，A-T丰富的DNA片段常呈B-DNA。若DNA双链中一条链被相应的RNA链所替换，会变构成A-DNA。当DNA处于转录状态时，DNA模板链与由它转录所得的RAN链间形成的双链就是A-DNA。由此可见，A-DNA构象对基因表达有重要意义。B-DNA双链都被RNA链所取代而得到由两条RNA链组成的双螺旋结构也是A-DNA。 1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG单晶的X-射线衍射图谱时分别发现Z-DNA结构。三、DNA超螺旋结构DNA三级结构双螺旋进一步扭曲双螺旋链再次螺旋负超螺旋（右手超螺旋）：双螺旋比正常少绕几圈，DNA处于过松状态所形成的超螺旋。正超螺旋（左手超螺旋）：双螺旋比正常多绕几圈，DNA处于旋紧状态所形成的超螺旋。四、RNA二级结构 在正常情况下，RNA分子以单链形式存在，但由于分子内氢键结合和链内碱基堆叠，局部可以形成螺旋样结构（如常见的干-环结构、发夹结构、突环结构等）。 RNA的主要功能是参与蛋白质合成。 构型多变性反映细胞内RNA功能的多样性。五、修饰加工的核酸 核苷酸或碱基的化学修饰非常普遍，并且具有功能上的重要性。细胞DNA的学修饰仅限于腺嘌呤N-6位和胞嘧啶5-位及4-氨基的甲基化（methylation）。噬菌体DNA可以发生更为复杂的化学修饰，这些化学修饰对限制性修饰、碱基错配修复和真核基因组结构具有重要意义。RNA在转录之后可以发生多种化学修饰，反映RNA在细胞内扮演多种角色。六、核酸的特性1、核酸的稳定性 表面上看， DNA双螺旋和RNA二级结构的稳定是通过碱基配对之间的氢键来维持的，但事实上核酸结构内存在的氢键通常并不提供稳定性，对DNA来说，还必须考虑单链随机螺线管状态与双链构型之间的能量差异。在双螺旋DNA中，氢键与碱基配对的特异性有关，但不能为螺旋结构提供总体稳定性，稳定的根本原因在于碱基之间的相互堆叠。游离的溶液中，芳族碱基是疏水性的, 即使是单链DNA，其碱基具有相互堆叠的倾向，在双链DNA中更为明显。 2、酸对核酸的影响 强酸和高温（如高氯酸和大于100）能将核酸彻底水解成碱基、戊糖和磷酸基等组成部分。在pH3-4的条件下，较低浓度的无机酸能选择性破坏能量较低的键（如嘌呤与核糖体之间的糖苷键），产生所谓的脱嘌呤核酸,据此可以有目的地设计更为复杂的化学反应，使核酸在特定的碱基处裂解，Maxam和Gilbert发明的核酸化学测序法就是根据这一原理设计的。3、碱对核酸的影响 （1）DNA pH7-8对DNA结构影响不大。鸟嘌呤等碱基在中性pH时以酮式为主，但在较高pH时则以烯醇式为主，这种互变异构影响碱基之间的特异结合，导致DNA双链的解体（变性）。（2）RNA较高pH能使RNA的局部螺旋区变性，但这种效应常常被RNA对碱水解的高度敏感性所掩盖。即使在中性pH环境中，RNA较DNA更易水解，这在实验操作时应特别注意。4、核酸的粘度 细胞DNA是非常纤细的分子，其直径约为2纳米，而长度可达数微米或毫米，真核细胞染色体DNA的长度甚至超过几公分，加之DNA是相对僵硬的分子，所以DNA溶液的粘度（viscosity）很高。细长的DNA分子容易受到机械剪切力和超声波的损伤，并伴随粘度的降低对制备高质量基因组DNA来说，机械剪切力（如吸取DNA溶液时所用滴头过细、用力过猛、过分震荡等）可能破坏DNA大分子的完整性，实验操作时应加以避免机械剪切和超声波仅仅使双链DNA的长度降低，而不能使DNA变性 5、核酸的浮密度 在高浓度（8M）氯化铯（CsCl）溶液中，DNA的浮密度与氯化铯溶液的浮密度相近,但在超速离心过程中，致密的CsCl逐渐向离心管的底部迁移，并最终形成平衡的密度梯度，而DNA则在相应的浮密度处形成清晰的条带若在梯度液中加入一定浓度的溴乙锭，单链RNA因与过多的溴乙锭结合而沉淀，蛋白质因不能结合而漂浮于梯度液的顶部，因此能将DNA与这两种杂质分离6、核酸的紫外吸收 核酸的最大吸收波长是260nm低色性是指与RNA 和单链DNA相比,双链DNA具有较低的光吸收值 核酸的纯度可用OD260/OD280比值表示, 纯度高的双链DNA的比值约为 1.8, 1.8提示有 RNA 污染, 1.8提示有蛋白污染 7、核酸的变性与复性化学物质（尿素、甲酰胺）和高温能破坏DNA和RNA的双链氢键结合区，这种现象称为核酸的变性。双链DNA和RNA的热变性特点具有明显的区别, RNA局部互补的碱基数随着温度的上升逐渐减少，碱基互补区愈短，变性的速度愈快，所以RNA变性是一个渐进的过程,而双链DNA只有当温度上升到特定温度（即所谓的熔链温度，Tm）时双链才能解开。Tm与DNA的G+C含量关系更为密切，其常用的计算公式为Tm(GC) 4(AT)2,对于长分子DNA来说，Tm一般在80-100之间。双链DNA变性后，其OD260值也随之改变（约增加40%）。降低溶液的温度可以使变性的DNA重新形成双链结构，这种现象称为DNA的复性或退火。快速降温有利于DNA分子内或分子间局部互补区的形成，而慢速降温能为单链DNA找到相应互补链提供足够的时间，从而有利于完全双链的形成。不同核酸链之间互补区的复性叫做杂交。第四章 染色体结构一、原核细胞染色体代表大肠杆菌染色体约4600kb闭合环状双链DNA分子形成50-100个环状的结构域末端固定于细胞膜的部分蛋白上（DNA结合蛋白）整体上超螺旋外，单个结构域也可形成超螺旋。二、染色质 真核细胞基因组DNA的总长度取决于动物的种类，但至少数千倍于原核基因组，并存在于多个独立的染色体中。每条染色体中的DNA是一条线性分子，长度可达几公分。真核细胞的所有基因组DNA都包装在细胞核内，这种包装以高度组织的DNA-蛋白复合物即染色质来完成，其中50%以上为蛋白质。（一）核小体 细胞分裂间期的细胞核在低渗溶液中膨胀,并释放染色质纤维染色质由独立的颗粒或亚单位(核小体)组成,其间由游离的双链DNA连接连接DNA微球菌核酸酶能在核小体之间的交界处切割线状DNA用微球菌核酸酶处理染色质可释放出核小体1、核小体结构模式对于不同来源的核小体而言，其结构具有高度相似性。 经微球菌核酸酶消化后，染色质可以释放出多个大小约为200bp 的DNA片段，这些片段与组蛋白八聚体核心（H2A）2（H2B）2（H3）2（H4）2相连，并松散地与一个H1分子结合，产生的结构单位称为核小体，其中的蛋白质对核酸酶的降解具有保护作用。如果延长消化时间，释放的核小体核心缺少H1分子，但对核酸酶具有坚强抵抗力。2、30 nm纤维当有H1组蛋白存在时，电镜照片上的核小体串珠表现为锯齿形结构。随着盐浓度的改变，核小体进一步形成直径为30nm的纤维，并盘绕成左手螺旋，每旋转一次约为6个核小体。在体内，大多数染色体DNA以30nm纤维形式包装。（二）染色质的高层次结构 在最高水平上，真核染色质的组织形式与原核DNA颇为相似。在电镜照片上，去除组蛋白的真核染色质也有与细菌DNA相似的环状结构域，尽管数量要多得多，但大小几乎相同，大约为100kb DNA。环状结构通过与核基质（蛋白复合物）结合而得以固定，环内的DNA以30nm纤维的形式存在，排列的高度约为300nm 三、有丝分裂期染色体 我们熟悉的染色体实际上是其细胞有丝分裂期的高度致密状态。在有丝分裂过程中，纺锤体将子代染色体拖向子代细胞，若不处于高度严实状态，数公分长的脆弱染色体DNA很容易被拉断一个染色体复制产生两个完全相同的姊妹染色单体，两者的连接部位称为着丝点，染色体的末端称为端粒1、着丝点 着丝点是有丝分裂中期两条姊妹染色单体的连接部位，也是动粒的装配部位。酵母着丝点DNA仅由88bp的富含AT的序列组成，其两边各有一个非常短的保守区。 哺乳动物染色体的着丝点由相当长的序列组成，其两边均有大量的重复DNA序列，称为卫星DNA （satellite DNA）。2、端粒 端粒是真核染色体线性DNA分子末端的特殊DNA序列，人端粒由数百拷贝短的重复序列（5-TTAGGG-3）组成，由专门的端粒酶合成，其合成机制不同于正常DNA的复制，这种独立复制方式可避免正常DNA复制不能拷贝线性DNA分子末端而造成的染色体逐渐变短。端粒DNA具有一种特殊的二级结构，对染色体末端具有保护作用。最近的研究结果表明端粒变短与细胞的衰老密切相关。3、几个概念：间期染色体异染色质常染色质4、DNase 高敏区及CpG岛没有结合蛋白保护的DNA骨架对DNaseI表现为高度敏感性。 基因组DNA中，5-CG-3（CpG）序列中胞嘧啶C-5位的甲基化（methylation）是一种重要的化学修饰 。哺乳动物细胞的CpG 序列通常发生甲基化，相对稀少，其原因是5-甲基胞嘧啶能自发脱氨基成为胸腺嘧啶，这种错误不是总被修复， 甲基化的CpG很快变成了TpG 基因组中还存在非甲基化的CpG岛（占总CpG的1%），岛内的CG二核苷酸平均比例较其它部位高得多，长度一般在2000bp左右CpG岛是DNA的DNaseI高敏区 四、基因组的复杂性1、非编码DNA 真核基因编码区常被多个内含子和其它功能尚不清楚的序列分隔，所以其基因一般长达几千kb，在这些非编码DNA中，大部分是序列不同但拷贝数相近的重复序列，可能呈串联排列，也可能以多拷贝形式散在于基因组中2、复性动力学3、几个概念 独特序列DNA 串联基因丛 散在重复DNA 卫星DNA第五章DNA复制一、DNA复制概述 复制子、复制起点与终点 半保留机制 半不连续复制 RNA引导1、复制子、复制起点与终点DNA中发生复制的独立单位称为复制子(Replicon)。每个复制子使用一次，并且在每个细胞周期中只有一次。复制子中含有复制需要的控制元件。在复制的起始位点具有原点，在复制的终止位点具有终点（Terminus)原核基因组中只含有一个复制子。真核生物的染色体包括很多复制子。复制发生的位点称为复制叉（Replication fork)，有时也称为生长点。复制叉从原点沿着DNA移动。复制可能是单向的，也可能是双向的。这由从原点形成一个或两个复制叉决定的。所有原核生物染色体、许多噬菌体以及病毒的DNA分子都呈环形，并由单一复制子构成，因此与唯一起点约180处就有一个单一终点。复制子：以单一单位复制的任一段DNA都称为复制子。起始点：复制子开始其复制的一段DNA序列。终止点：复制子通常停止其复制的一段DNA序列。2、半保留复制机制1958年，Meselson和Stahl研究了经15N 标记的大肠杆菌，首次证明了DNA的半保留复制。3、半不连续复制验证试验：E.coli用3H-脱氧胸腺嘧啶（一个具放射活性的DNA前体）标记几秒钟，用碱性蔗糖梯度对新生DNA进行离心，根据分子大小，变性DNA的单链会分开，结果发现大量新合成的10002000nt（真核中是100200nt）长的小片段。如果这些细胞进而在未标记的胸腺嘧啶中培养，这些冈崎片段很快便连成大分子的DNA。4、RNA引导对冈崎片段的仔细研究，与前导链的头几个一样，每一片段5端的头几个核苷酸均是核糖核苷酸，因此DNA合成是由RNA引导的。这些引物在片段连接之前被去掉，产生间隙由DNA填补。用RNA引导DNA复制的原因可能是出于保证DNA复制的高忠实性。二、DNA复制具体过程双链DNA的复制是一个涉及酶活动的复杂的聚合反应过程，可分为起始、延伸和终止三个不同的阶段。起始阶段：涉及蛋白复合物对复制原点的识别, 在DNA合成开始前,双链DNA必需分离,并维持暂时的单链状态,然后在复制叉处开始子链的合成。 延伸阶段：由另一蛋白复合物(复制体)负责, 随着复制体沿着DNA移动,母链解链和子链合成开始。终止阶段：在复制子的末端有特定的终止序列,复制体到达终止序列时便停止DNA合成,合成终止后,复制的染色体必需分离到子代细胞中。1、DNA复制过程中所需要的一些酶（1）DNA解旋酶（DNA Helicases） （2）单链结合蛋白（DNA single-stranded binding proteins，SSB蛋白） （3）DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase) （4）DNA 聚合酶（DNA polymerase） 大肠杆菌DNA聚合酶、和的性质比较聚合酶聚合酶聚合酶53聚合酶活性+35外切酶活性+53外切酶活性+-新生链合成-+相对分子量（103）10390900细胞内分子数400?1020生物学活性10.0515已知的结构基因polApolBpolC (dnaE,N,Z,X,Q)真核生物DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶相对分子质量(103）1102204560在细胞内的分布核内核内核和线粒体内功能DNA复制DNA损伤修复?相对活性约80%10%15%2%15%亚基数多个1个1个（5）引发酶（Primase） （6）DNA连接酶（DNA Ligase ）2、DNA复制的一般模式 （1）在DNA旋转酶、DNA螺旋酶以及单链结合蛋白的作用下DNA分子被解旋，准备下面的合成。 （2）游离的3OH 为复制所必须，但当双链分开后，不存在这样的游离基团，这时合成的RNA引物提供游离的3OH并开始复制。（3）复制叉朝一个方向移动，但DNA复制的方向只能是53进，这通过冈崎片断来解决，形成后随链中不连续的短小片断，而前导链则为一连续的DNA片断。 （4）DNA聚合酶I的外切酶活性，切除RNA引物。 （5）DNA 聚合酶I发挥53聚合酶活性，补平由RNA引物留下的沟。 （6）DNA 连接酶灾补平最终残留的小缺口。 3、末端复制问题（The end-replication problem）后随链合成中所需要的引物将被去除。在染色体末端，最后一个引物被去除后，这一段空隙不能合成。因此，后随链与模板相比，至少要少一个引物的长度。这就是所谓的“末端复制问题”。细菌的DNA 是环状的，因此不存在末端复制问题。在真核细胞中，染色体末端的端粒结构至少有两方面的功能：防止染色体间互相融合以及解决末端复制问题。第六章 DNA损伤、修复及重组一、诱变（一）突变1、定义：突变是DNA碱基序列水平上的永久性的、可遗传的改变，包括碱基的替换、插入和缺失。2、突变产生的原因：DNA复制或减数分裂重组过程中的自发性错误物理或化学试剂损伤DNA3、点突变：单一碱基的改变。转换：嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间互换 AGT C颠换：嘌呤与嘧啶之间发生互换 A T or C T A or G G T or C C A or G4、点突变的表型效应：（1）沉默突变：发生在DNA的非编码区、非调节区或密码子的第3个碱基位置，突变不会影响掺进蛋白质中的氨基酸。（2）错义突变：改变了基因产物的1个氨基酸。（3）无义突变：形成新的终止密码子的突变。结果会产生截短了的蛋白质产物。5、插入突变/缺失突变：涉及一个或多个碱基的增加或丢失，这会引起基因的移码突变。（二）复制忠实性碱基配对的错误频率约为10-1-10-2 在DNA复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10-5-10-6 DNA聚合酶还会暂停催化作用，以其3-5外切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸，然后再继续正确的复制校正后的错配率仍约在10-10左右，即每复制1010个核苷酸大概会有一个碱基的错误 （三）诱变剂1、物理诱变剂 紫外线是引起DNA损伤的最重要的方式。当DNA受到最易被其吸收波长（260nm）的紫外线照射时，主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环连成二聚体，其中最容易形成的是T-T二聚体。人皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5104/细胞，但只局限在皮肤中，因为紫外线不能穿透皮肤。但微生物受紫外线照射后，就会影响其生存。紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。 电离辐射电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤，间接效应是指DNA周围其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。 碱基变化 主要是由OH-自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。脱氧核糖变化 脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。DNA链断裂 这是电离辐射引起的严重损伤事件，断链数随照射剂量而增加。交联 包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联。同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间可以共价键结合，DNA与蛋白质之间也会以共价键相连2、化学诱变剂 碱基类似物、修饰剂碱基类似物：是改变碱基配对特性的正常碱基衍生物。亚硝酸：CU，从而U和A 配对，引起GCAT转换 烷化剂烷化剂：如甲烷磺酸甲酯（MMS）、乙基亚硝基尿（ENU）等，可使DNA发生各种类型的损伤。碱基烷基化 碱基脱落 断链 交联 （四）诱变的类型1、直接诱变：起因于DNA中存在稳定的、具有改变了配对特性的未修复的碱基。正是DNA的复制使得这种损伤（非永久性的）固定下来成为突变（永久性的，可遗传的）。2、间接诱变化学和物理诱变剂导致损伤的绝大部分，在与复制叉相遇之前会成为一种或多种DNA修复机制作用的目标，从而恢复到无差错状态的DNA原初结构。如果损伤发生在移动着的复制叉之前，这会导致在子链上产生一个致命的缺口，此时细胞不得不采取“转移损伤DNA合成”。转移损伤DNA合成有可能正确，从而插入正确的碱基，但被破坏的碱基往往失去了特殊的碱基配对性，所以一些损伤DNA聚合酶只是为了保证染色体的完整性在损伤对应的位点上插入错误的碱基，这就叫间接诱变。二、DNA损伤1、定义：DNA物理或化学结构的改变。碱基杂环上的一些N和C原子以及环外功能团具有相当的化学活性，许多外源物质（如化学试剂、射线等）能引起这些位点的改变。如果损伤允许在DNA中保留下来，这一突变就会通过直接诱变或间接诱变而被固定下来。DNA损伤可以是致突变和（或）致死。2、损伤类型：（1）自发性DNA损伤：DNA内在的化学活性以及细胞中存在的正常活性化分子导致的DNA损伤。转氨作用（CU）脱嘌呤作用脱嘧啶作用（2）氧化性损伤在所有需氧细胞中由于超氧化物、氢过氧化物和羟基自由基等活性氧（ROS）的存在，在正常情况下会发生氧化损伤（3）烷基化烷化剂：可将烷基（如甲基）加入到核酸上各种位点的亲电化学试剂。常见的有甲烷磺酸甲酯（MMS）和乙基亚硝基尿（ENU）。注意：有别于正常甲基化酶的甲基化位点。（4）聚化加合物紫外线照射可通过DNA链上相邻嘧啶每个碱基的C5双键和C6碳原子环化形成一个环丁烷环从而形成环丁烷嘧啶二聚体。一个嘧啶上的C6和其相邻碱基上的C4间生成键后形成另一种嘧啶二聚体6,4-光产物。煤焦油中的致癌物苯并芘在肝内由细胞色素P-450代谢后，其中的一种代谢产物可与鸟嘌呤残基共价结合。致癌物黄曲霉毒素B1也可与DNA共价结合，导入大块加合物，从而在DNA复制过程中改变遗传信息。三、DNA修复1、光复活在可见光存在的情况下，DNA光复活酶（光解酶）可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体。光复活对嘧啶二聚体具有专一性的，修复是无差错的，是损伤被“直接修复”的一种例子。2、烷基转移酶3、切除修复是一种普遍存在的修复机制，可在一系列的损伤中起修复作用，并且这种修复是无差错的。切除修复有2种形式：核苷酸切除修复（NER）、碱基切除修复（BER）。4、错配修复是切除修复的一种特定形式，用于修复在复制中错配并漏过校正检验的任何碱基。复制错配中的错配碱基存在于子代链中。因此该系统必须在复制叉通过之后有一种能识别亲本链与子代链的方法，以保证只从子代链中去除错配碱基。在 E. coli中，出现在 GATC 序列中的A常常是甲基化的，子链的甲基化在复制完成几分钟后随即进行。所以新合成的DNA是半甲基化的，即亲本链是甲基化的，而子链未被甲基化 ，这样就可以很容易区分它们。5、重组修复6、SOS修复四、重组1、同源重组又称“一般重组”，涉及两个DNA分子间同源区域的交换。2、位点特异性重组指非同源DNA的特异片段之间的交换，由能识别特异DNA序列的蛋白质所介导，并不需要RecA或ssDNA。3、转座作用转座子或转座元件是一些较短的DNA序列，可以转移进细胞基因组中的几乎任何位置。转座作用又称为异常重组（非正常重组），因为它不需要序列间具有同源性，也不是位点特异性的。IS（insertion sequences，IS）序列是最简单的大肠杆菌转座序列，每个基因组中可能有几个拷贝，其长度在1-2kb之间。第七章 基因操作基因工程(gene engineering)重组DNA(recombinant DNA)1、对人类遗传信息的认识2、基因工程药物与疫苗（1）基因工程疫苗1986年美国正式批准基因工程乙肝疫苗投放市场（HbsAg）（2）基因工程肽类药物各种干扰素（interferon，IFN）生长激素（growth hormone，GH）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（3）基因工程抗体美罗华嵌合抗体（抗CD20）3、转基因动植物4、疾病诊断、治疗一、介绍几个概念1、DNA克隆（clone）：将相对短的基因组片段或mRNA的DNA拷贝插入自我复制的载体，将形成的重组DNA（recombinant DNA）分子在细菌等宿主生物中大量复制，产生一系列遗传上相同的生物群体，通常称为一个克隆，相应过程称为DNA克隆或重组DNA技术。2、宿主（host）：可供外援DNA进行复制或表达的宿主细胞，如大肠杆菌、酵母等。3、载体（vector）：能够自身复制，易与宿主细胞基因组分离，且可插入外源DNA片断的DNA分子，如常用的大肠杆菌克隆载体：质粒载体、噬菌体载体。4、亚克隆（subcloning）：指将克隆在一个载体中的DNA片段转移至另一个载体的过程。5、DNA文库（DNA library）： DNA可以是直接从细胞中分离的基因组DNA，也可以是从表达特定基因细胞中提取的mRNA的DNA拷贝（即cDNA），将这些DNA插入到质粒或噬菌体载体中，以获得的重组分子转化细菌或感染细胞，获得的全部克隆称为DNA文库，包括基因组DNA文库和cDNA文库。二、质粒DNA的制备1、什么是质粒？质粒（plasmid）是一种独立与染色体外，能进行自主复制的细胞遗传因子，它能在完整细菌间进行传递，也能在细菌分裂时伴随染色体分配到子代细菌，但它并不是细菌生长繁殖所必须的遗传物质。质粒控制着多种不同的遗传性状，尤其与细菌的抗药性、致病性有关。2、制备实验室最常用的方法碱裂解法三、DNA限制性内切酶及电泳分析、回收1、DNA限制性内切酶三大技术发明之一，为基因的切割创造了条件。本质是细菌的一种抵御外来DNA侵入的原始防御机制。种类繁多，各有特性识别序列多数限制酶识别4-8bp的回文序列（序列相同，方向相反），如EcoR限制酶识别6bp回文序列，其切割产物是两条双链片段（称为限制片段），其5 端是带有磷酸基的单链突出端，而3 端具有游离的羟基。酶切条件：温度、离子浓度、pH、酶切时间等 Sma 30 Sfi 502、DNA琼脂糖凝胶电泳分析与回收四、连接、转化、重组子鉴定 1、DNA片断与载体的连接2、细菌的转化感受态细胞（competent cell）：用含钙离子的溶液处理大肠杆菌，使其获得短暂吸收外源DNA的能力，这种状态的细菌称为感受态细胞。转化（transformation）：将外源DNA转入细菌细胞的过程。常用的一些转化方法：CaCl2转化法、电转化法等。3、重组菌的培养及鉴定（1）培养根据载体上的抗性基因，选择合适的培养基。如载体pGEX带有ampr，则可培养基中加入氨苄青霉素。（2）筛选、鉴定蓝白斑筛选限制酶切分析、琼脂糖电泳PCR鉴定探针筛选表达筛选等4、菌种的保存15%的甘油缓冲液冻干保存第八章 原核细胞基因转录与调节一、转录的基本原理（一）概述基本概念RNA聚合酶的功能是复制双链DNA的其中一条链形成RNA模板链（反义链）RNA编码链（有义链） RNA序列与模板链互补与编码链相同RNA聚合酶催化RNA的合成，当RNA聚合酶与DNA基因的起始端一段特别的区域启动子结合时，RNA转录便开始了。启动子位于起始点即转录成RNA的第一个碱基处周围。