药学本科分子生物学实验指导.doc

实验项目一：总RNA的提取（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。 三、实验内容 利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。四、实验要求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。五、实验所需仪器设备移液器及吸头， 电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等六、实验原理 TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA； 七、实验步骤1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2. 将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4冷冻离心机冷却到4（预冷半个小时）。准备冰盒。5戴口罩， 戴手套 。6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂，7. 超声破碎仪破碎细胞8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。9加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。10. 离心：4，13,000rpm，10min。11取新EP管。将上层水相（约600uL）加入新EP管，12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。13. 离心：4，13,000rpm，10min。14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，5510min，以完全溶解RNA。15 .-70度保存提取的总RNA。八、注意事项 1RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。2RNA提取用品准备：1）普通的玻璃器皿：180烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。3）用烘烤过的药勺称取试剂。4）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37至少处理12小时，高压灭菌15min。实验结果:成功从植物中分离得到总RNA实验项目二：总RNA的纯化和鉴定（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法 三、实验内容 1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA四、实验要求1、学会纯化植物总RNA的方法2、学会定量、定性检测RNA的方法五、实验所需仪器设备移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计六、实验原理 乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。在阳离子的足量时，可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使RNA沉淀。反复利用乙醇沉淀RNA，可以起到纯化RNA的作用。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，总RNA电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/l）=OD260n (稀释倍数)40七、实验步骤（一）总RNA的纯化1提取的总RNA，加入75%乙醇500uL洗涤。2. 离心：4，7,500rpm，5min。3去上清液，加入无水乙醇500uL洗涤。4 离心：4，7,500rpm，5min。5去上清液，空气干燥5-10分钟。（RNA不可以完全干燥，防止复溶的时候困难）6. 加入20-30 uL DEPC水，5510min，以完全溶解RNA。（二） 总RNA质量的检测（完整性的检测）1称取琼脂糖0.25 g，溶于盛有30ml的 50TAE（电泳缓冲液）的锥形瓶中；母液为50TAE: 242 g Tris 碱+ 57. 1 ml 冰醋酸+ 37. 2 g Na2EDTA2H2O 配成1L 于4 储备)，2将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化为准）；加热时应盖上盖子,以减少水份蒸发。 3在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上，用清洁的挡板封住电泳板的两端形成模具；4从微波炉中取出已经完全熔化的凝胶溶液，片刻冷却后，用吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的两边封住；5向锥形瓶中加入10 mg/ml的溴化乙锭（EB）1 l（终浓度0.5 g/ml，EB插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间后，能形成一种在紫外光下发光的络合物，容易观察）,轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液；6将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中（避免出现气泡）；倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。如果出现明显的气泡，可用刀片赶走，然后插入合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在电泳板底面以上0.5 1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔；7让凝胶溶液在室温下完全凝结（需1 h左右）后小心将梳齿拔起；待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶。8 将凝胶安放到电泳槽内，向电泳槽加入电泳缓冲液（1 TAE），要求没过凝胶；因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。9 在干净的一次性手套上混合RNA样品和6 上样缓冲液（5 l 样品混合1 l 6 上样缓冲液）；10用枪将样品混合液缓慢加入点样孔内；每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 并加入4ul的DNA marker，作为标记。11接好电极插头。 出孔电压为100 v（约2min）；出孔以后电压用70 v，电流在40mA以上；电泳30分钟左右，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，关上电源。注意DNA或RNA的泳动方向，防止反方向泳动而跳海。12 观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察电泳胶板。RNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。电泳可见明显两条带，RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，说明抽提的RNA质量高。常用电泳缓冲液制备：1TAE: 40Mm Tris-乙酸 1mM EDTA1TPE: 90mM Tris-磷酸 2mM EDTA0.5TBE: 45Mm Tris-硼酸 1mM EDTA凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%蔗糖或（15%聚蔗糖400 30%甘油）（三） RNA浓度与纯度的检查1取样本RNA 1 l加99 l DEPC处理水（稀释100倍）；2准备一管DEPC处理水以调零；3开仪器后部的开关；4按“RNA”键即为检测RNA；5取比色皿一个，用DEPC处理水洗一遍；6加DEPC处理水到比色皿后将比色皿放置在仪器指定位置，按“blank”键 调零（放比色皿时注意光面和毛面；手接触毛面，光线透过的应该是光面）；7取出比色皿，吸干前液；8吸样品液到比色皿的凹槽内，将比色皿放置在仪器指定位置，按“sample” 键后记录下仪器显示的样品浓度和A260/A280值（其比值可以判断核酸样品的浓度，对于DNA样品比值应在1.6-1.8之间，小于1.6有蛋白质的污染，大于1.8有RNA污染对于RNA比值应在2.0以上，如果小于2.0表示蛋白质或苯酚的污染。）9实验结束后将比色皿洗干净备用。10. 以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/l）=OD260n (稀释倍数)40八、注意事项 1RNA纯化时动作轻柔，防止RNA分子断裂2. 防止RNA酶水解RNA3. 乙醇沉淀RNA时，不可完全干燥，否则不可以RNA难以复溶4. 由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。5. 不同组织或细胞中提取RNA预期得率植物叶片100200 g/g 叶片 动物组织200400 g/g 肝脏组织动植物培养细胞510 g/106细胞革兰氏阴性细菌210 g/ml DH5过夜菌血液35 g/ml 人全血实验结果：电泳可见明显两条带，RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，说明抽提的RNA质量高。并且紫外分光光度法测得的RNA的浓度和纯度复合实验预期，可以进行下一步的RT-PCR的实验。实验项目三：PCR基因扩增一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 三、实验内容 PCR反应四、实验要求正确操作PCR仪器,学会做一般PCR反应。五、实验所需仪器设备移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪，台式高速离心机，PCR仪六、实验原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。七、实验步骤（一）RNA反转录产生cDNA (均使用25ul的反应体系，使用大鼠 GAPDH（甘油醛-3-脱氢酶）做引物)1 oligdT 1UL RNA 总量2ug(根据测的样品浓度) DEPC H2O (15-oligdT-RNA) 轻弹几下后离心，总体积共15ul。 2 72变性10min ，迅速置冰上。（可以在PCR仪上设定相应的程序）3一次加入下列试剂: 混匀,短时离心。25ul体系50ul体系5MM LVRT buffer 5ul10uldNTP(25mM/each)5ul10ulRnase inhibition (40u/ml)0.6ul1.2ulM-MLV-RT(逆转录酶)1ul2ul 说明: RNA酶抑制剂和逆转录酶在加样前从-20冰箱取出.所用的PCR管和吸取RNA所用的枪头都是DEPC 水处理的,余用消毒的就可!4 42 60min 953min 4 进行逆转录.（可以在PCR上设定相应的程序）（二）PCR1 备一套新PCR反应管，按顺序加入以下物质 50ul 体系(ul)25ul体系(ul)无菌水35.7517.87510Taq buffer with Mg2+52.5dNTP (25mM/EACH)42引物110.5引物210.5cDNA31.5Taq酶0.250.25说明: Taq酶加样前取出. cDNA用后存于-70冰箱.用TAE稀释引物.10倍稀释为储存液，再5倍稀释为工作液。2 加完样后混匀，稍离心.再加入15ul/管 矿物油（mineral oil），封闭，防止液体挥发。3 regular PCR (约1.5h) 952min。 9430s， 6230s ， 721min 。(共35个循环) 72 15min，4。八、注意事项 1该实验使用的样品为RNA，因此在反转录过程中，要特别注意防止RNA酶的污染。2取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起气泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。3为防止RNA分解，应避免多次冻融，应将RNA少量分装后保存于-70中。九、实验结果成功从细胞总RNA中利用RT-PCR技术，扩增出目的基因。实验项目三：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的方法。 三、实验内容 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物四、实验要求正确操作使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的方法五、实验所需仪器设备移液器及吸头，硅烷化的PCR小管， 台式高速离心机，PCR仪，琼脂糖，TE、水平电泳仪、EB六、实验原理完全变性的条件下，RNA的泳动率与分子量的对数呈线性关系。使用一定分子量的Marker作为标记，就可以检测出样品RNA的碱基对数，从而判断检测样品中是否含有PCR扩增产物。通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。七、实验步骤1称取琼脂糖0.25 g，溶于盛有30ml的 50TAE（电泳缓冲液）的锥形瓶中；母液为50TAE: 242 g Tris 碱+ 57. 1 ml 冰醋酸+ 37. 2 g Na2EDTA2H2O 配成1L 于4 储备)，2将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化为准）；加热时应盖上盖子,以减少水份蒸发。 3在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上，用清洁的挡板封住电泳板的两端形成模具；4从微波炉中取出已经完全熔化的凝胶溶液，片刻冷却后，用吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的两边封住；5向锥形瓶中加入10 mg/ml的溴化乙锭（EB）1 l（终浓度0.5 g/ml，EB插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间后，能形成一种在紫外光下发光的络合物，容易观察）,轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液；6将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中（避免出现气泡）；倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。如果出现明显的气泡，可用刀片赶走，然后插入合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在电泳板底面以上0.5 1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔；7让凝胶溶液在室温下完全凝结（需1 h左右）后小心将梳齿拔起；待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶。8 将凝胶安放到电泳槽内，向电泳槽加入电泳缓冲液（1 TAE），要求没过凝胶；因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满