第七章 微生物的遗传变异和育种.pdf

1 第七章第七章 微生物的遗传变异和育种 微生物的遗传变异和育种 8 学时 学时 微生物的遗传变异和育种是微生物学中的重要内容 要求学生掌握微生物遗传变 异的特点和规律 微生物育种的方法 微生物的基因重组 微生物的衰退 复壮和 保藏 一 几个基本概念一 几个基本概念 1 遗传 生物体的最本质的属性之一 是指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给 下一代的行为或功能 它具有极其稳定的特征 2 遗传型 genotype 又称基因型 指某一生物个体所含的全部遗传因子即基因的总和 遗传型是一种内在可能性或潜力 其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息 3 表型 phentype 指某一生物所具有的一切外表特征及内在特征的总和 是遗传型在合 适环境下的具体体现 是一种现实性 4 变异 指生物体在某种外因或内因的条件下所引起的遗传物质结构或数量改变 亦即遗 传型的改变 变异的特点 在群体中以极低的几率出现 性状变化的幅度大 变化后 的新性状是稳定的 可遗传的 5 饰变 modification 指不涉及遗传物质的结构改变而只发生在转录 转译水平上的表 型变化 特点 在整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化 性状变化幅度小 饰变是 不遗传的 二 微生物适于作研究对象的原因 二 微生物适于作研究对象的原因 1 个体的体制极其简单 2 营养体一般都是单倍体 3 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖 4 繁殖速度快 5 易于积累不同的中间代谢物或终代谢物 6 易于形成营养缺陷型 7 各种微生物一般都有相应的病毒 8 存在多种处于进行过程中的原始有性生殖方式 第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础 遗传变异的物质基础问题 是生物学中的一个重大理论问题 围绕这一问题 曾有过多种推 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 2 测和争论 1944 年 三个著名实验以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 是遗传变异的物质基础 一 三个经典实验一 三个经典实验 一 经典转化实验 1 菌种 肺炎双球菌 肺炎链球菌 球形菌种 常成双或成链排列 可使人患肺炎 也 可使小鼠患败血症死亡 2 试验 1944 年 Avery 转化试验 P222 DNA 为遗传物质基础 二 噬菌体感染实验 1952 年 A D Herskey M Chase 核酸 32P 放射线 32P 35S 标记培养增殖噬菌体 外壳 35S 两组实验 1 含 32P DNA 的噬菌体作感染实验 E coli 2 含 35S 蛋白质 外壳 的噬菌体感染实验 上清液 75 放射性 噬菌体 35S 吸附 侵入 离心 沉淀 25 放射性 进一步培养 产生大量完整噬菌体 以上说明沉淀为 DNA DNA 为遗传物质 三 植物病毒的重建实验 1956 H Fraenkel Conrat TMV 烟草花叶病毒 HRV 霍氏车前病毒 S 型 有荚膜 菌落表面光滑 致病性 两种菌株 R 型 无荚膜 菌落外观粗糙 无致病性 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 3 TMV 核酸 RNA 二 遗传物质在细胞中存在的部位和方式二 遗传物质在细胞中存在的部位和方式 一 遗传物质在细胞中存在的部位和方式 七个水平 1 细胞水平 大部分或几乎全部 DNA 都集中在细胞核或核质体中 2 细胞核水平 真核生物和原核生物的细胞核存在明显差异 原核 没有核膜 呈松散无定型的核质体状态 DNA 不与蛋白质结合 真核 有核膜 DNA 与组蛋白结合在一起 形成染色体 除核基因外 无论是真核还是原核都存在细胞质基因 或核外染色体 核外基因 后面作 详细探讨 3 染色体水平 4 核酸水平 绝大多数 DNA 1 种类 部分病毒遗传物质是 DNA 真核中 与蛋白结合形成染色体 2 与蛋白结合情况 原核中 DNA 单独存在 绝大多数微生物的 DNA 是双链 3 核酸结构 少数病毒的核酸为单链结构 4 DNA 长度 真核比原核长得多 但不同的生物间差别很大 原核生物中 呈环状 病毒粒子中 呈环状或线状 5 存在状态 同是双链 DNA 细菌质粒中 超螺旋 麻花 状 5 基因水平 生物体内一切具有自主复制能力的遗传功能单位 原核生物基因调控系统 P 225 操纵子学说 6 密码子水平 这个密码子是由三个核苷酸顺序所决定的 它是负载遗传信息的基本单位 7 核苷酸水平 碱基水平 最低突变单位或交换单位 基因水平 遗传的功能单位 单倍体 真核生物 不同生物 染色体数目不同 染色体套数不同 双倍体 原核生物 每个核质体由一个裸露的 光学显微镜下无法看到的环状染 色体组成 同核酸水平 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 4 密码子水平 信息单位 DNA A T G C 4 种脱氧核苷酸 二 原核生物的质粒 1 定义 游离子原核生物染色体外 具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA 分子 即 cccDNA 称为质粒 具有螺旋状结构 分子量一般在 106 108Da 间 大小约为 1 核基因组 2 功能 对生物体本身生长繁殖来说 非必需 但于它在外界环境中生存需要 如接合 产毒 抗药 固氮 产特殊酶或将解毒物等 3 质粒类型 严紧型复制控制 复制与染色体同步 1 2 个 cell 按控制方式分 松弛型复制控制 与染色体不同步 10 15 个 cell 4 特征 1 自我复制性 2 携带特殊基因 接合 产毒 抗药 固氮 产特殊酶 降解毒物等 3 整合性 可于核染色体整合和脱离 附加体 如 F 因子 4 重组性 可在质粒与质粒之间 质粒与核染色体间发生重组 5 转移性 可在同种异株细胞间转移 如 F 因子 R 因子 6 消除性 外界条件不适宜 复制与染色体不同步 消除 5 质粒的分离与坚定 细胞裂解 pr 与 RNA 的去除 设法使染色体 DNA 与质粒 DNA 分离 鉴定 电镜 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳 6 几个代表性的质粒简介 1 F 因子 fertility factor 又称致育因子或性因子 是 E coli 等细菌中决定性别的质粒 F 有 F 质粒 有性菌毛 F 无 F 质粒 无性菌毛 分子大小 94 5kb 功能 与结合作用有关 2 R 因子 resistance factor 又称 R 质粒 抗性质粒 a 结构 由相连的两个 DNA 片段组成 RTF 质粒 抗性转移因子 含有调节 DNA 复制和拷贝数的基因及转移基 因 有时还有四环素抗性基因 抗性决定质粒 r 含有其它抗生素的抗性基因 b 拷贝数 R 因子在细胞内的拷贝数可从 1 2 个到几十个 分为 严谨型控制 松弛型控制 c 应用 R 因子对多数抗生素具有抗性 因此可作为筛选时的理想标记 也可作为基因载体 3 col 因子 colicinogenic factor 即产大肠杆菌素因子 大肠杆菌素 colicin 是一种由 E coli 的某些菌株所分泌的细菌素 具有通过抑制复制 转录 转译或能量代谢等而专一杀死其 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 5 它肠道细菌的功能 许多细菌都能产生其它原核生物致死的蛋白质类细菌毒素 大肠杆菌素由质 粒 Col 因子编码 ColE1 分子量小 无接合作用 Col 因子可分为两类 ColIb 分子量大 与 F 因子相似 可通过接合转移 属严谨型控制 Col 因子本身编码一种免疫蛋白 使带 Col 因子的菌株对大肠杆菌素有免疫作用 不受其伤害 4 Ti 质粒 tumor inducing plasmid 即诱癌质粒 根癌土壤杆菌可引起许多双子叶植物 的根癌 它是由该菌的 Ti 质粒引起的 Ti 质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体 一些具有主要性状的外源基因可借 DNA 重 组技术设法插入到 Ti 质粒中 并进一步使之整合到植物染色体上 以改变该植物的遗传性 达 到培育植物优良品种的目的 5 巨大质粒 mega 质粒 近年来在根癌菌属中发现的一种质粒 分子量比一般质粒大 几十倍至几百倍 故称巨大质粒 其上有一系列固氮基因 6 降解性质粒 只在假单胞菌属中发现 它们的降解性质粒可分为一系列能降解复杂物 质的酶编码 从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源 第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种 一 一 基因突变基因突变 一 突变 gene mutation 简称突变 是突异的一种 指生物体内遗传物质的分子结构突 然发生的可遗传的变化 突变的几率很低 一般 10 6 10 9范围内 二 突变率 mutation rate 每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率 称突变率 每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目 三 突变类型 突变的类型很多 从实用的目的出发 按突变后极少数突变株的表型是否能在选择性培养基 上加以鉴别来区分 营养缺陷型 株 选择性突变株 抗性突变型 株 突变株 条件致死突变型 株 的表型 形态突变型 株 非选择性突变株 抗原突变型 株 产量突变型 株 1 营养缺陷型 auxotroph 某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失一种或几种生长因 子的能力 因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型 可在加有某生长因子的基本培养 基上选出 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 6 2 抗性突变型 resistant mutant 由于基因突变而使原始菌株产生了某种化学药物或致死 物理因子抗性的变异类型 如对各种抗生素的抗药性菌株 3 条件致死突变型 conditional lethal mutant 某菌株或病毒经基因突变后 在某种条件 下可正常生长 繁殖的突变类型 称为条件致死突变型 Ts 突变株 温度敏感突变株 是一类典型的条件致死突变型 如 E coli 的某些菌株可在 37 下正常生长 却不能在 42 下生长等 产生 Ts 突变株的原因是突变引起了某些重要的蛋白质的结构和功能的改变 以至在某特定 的温度下能发挥其功能 而在另一温度下则不能 4 形态突变型 morphological mutant 由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选 择性变异 5 抗原突变型 antigenic mutant 由于基因突变而引起的抗原结构发生突变的变异类型 如细胞壁缺陷变异 荚膜变异等 6 产量突变型 通过基因突变而获得的在有用代谢产物产量上高于原始菌株的变异株 也称高产突变株 high producing mutant 产量性状 多因子决定 突变机制较复杂 正变株 产量突变株 负变株 四 突变的特点 基因突变的一般规律 以细菌的抗药性或抗噬菌体的特性为例 细菌产生抗药性的三条途径 基因突变 抗药性质粒 R 因子 的转移 生理上的适应性 基因突变的 7 个特点 1 不对应性 突变的性状与突变的原因间无直接的对应关系 这是突变的一个重要特点 三个经典实验的证明 后面讲 2 自发性 各种性状的突变 可在没有人为的诱变因素处理下自发地产生 3 稀有性 突变几率低 一般 10 6 10 9 4 独立性 可同时发生多种类型的突变而互不影响 两基因同时突变的频率 A 的频率 B 的频率 5 诱变性 诱变剂可提高自发突变的几率 一般可提高 10 105倍 诱变剂 提高诱变率的作用 6 稳定性 新性状是稳定的 可遗传的 五 基因突变的自发性和不对应性的证明 抗性突变产生抗性的原因 争论十分激烈 一种观点 通过适应而产生 环境诱发产生 突变的原因和性状间是相对应的 定向变异 驯化 驯养 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 7 另一种观点 基因突变是自发的 且与环境是不对应的 1943 年 三个经典实验解决了这场纷争 1 变量实验 fluctutation test 又称波动实验或彷徨实验 S E Luria 和 M Delbr ck 1943 年 噬菌体的作用 仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用 2 涂布实验 Newcombe experiment P232 说明 抗性突变发生在接触噬菌体之前 噬菌体的加入只是起甑别这类自发突变是否发生的 作用 而不是诱导突变 3 影印培养实验 replica plating 1952 年 Lederberg 发表 平板影印培养法和细菌突变株 的间接选择 一文 更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的 这一突变与 相应的药物环境毫不相干 1 平板影印培养法 实质上是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型 菌落的接种培养法 2 实验过程 平板影印培养法不仅在微生物遗传理论的研究中有重要作用 而且在育种实践和其它研究中 均有应用 值得很好的领会 说明 突变的自发性 六 基因突变的机制 转换 A G T C 碱基置换 A G A C 点突变 颠换 G C G T 诱变 移码突变 缺失 重复 突变 畸变 添加 易位 插入 倒位 自发突变 1 诱变机制 诱变剂 凡能提高突变率的任何理论因子 称为诱变剂 mutagen 1 碱基置换 substitution 只涉及一对碱基被另一对碱基所置换 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 8 转换 一个嘌呤被另一嘌呤或一个嘧啶被另一嘧啶所取代 置换 颠换 一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所取代 A T T A A T C G G C C G 双链 DNA 单链 DNA 实线代表转换 虚线代表颠换 直接引起置换的诱变剂 一类直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂 如 亚硝酸 羟 氨 各种烷化剂 N 甲基 N 硝基 N 亚硝基胍 超级诱变剂 间接引起置换的诱变剂 都是一些碱基类似物 如 5 溴尿嘧啶 5 Bu 5 氨基尿嘧啶 5 Au 等 他们通过活细胞的代谢活动掺入到 DNA 分子中后而引起 2 移码突变 指诱变剂使 DNA 分子中的一个或少数几个核苷酸的增添 插入 或缺失 从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变 由移码突变产生的突变株称为移码突变株 如 吖啶类染料以及一系列称为 ICR 类的化合物 P238 3 染色体畸变 DNA 的大损伤 包括缺失 重复 易位和倒位 也包括染色体数目的变 化 诱变因素 如 X 射线等辐射 烷化剂 亚硝酸等 类型 染色体内畸变 只涉及一条染色体上的变化 染色体间畸变 指非同源染色体间的易位 转座因子 目前已把在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段 DNA 顺序称作转 座因子 也称作跳跃基因或可移动基因 转座因子的种类 IS 插入序列 转座子 Tn 又称转位子 易位子 Mu 噬菌体 诱变噬菌体 强调 许多诱变剂的诱变作用都不是单一机制 如亚硝酸 碱基对的转换和染色体畸变 电离辐射 基因突变和染色体畸变 2 自发突变机制 1 自发突变定义 在指在没有人工参与条件下生物体自然发生的突变 所谓 自发 并 不是没有原因 只是人们还没有对它很好 很具体的认识而已 2 几种自发突变的可能机制 背景辐射和环境因素的诱变效应 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 9 过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物 它对 Neurospora 脉孢菌 有诱变作用 过氧化氢可能是一种 内源性诱变剂 证明 加入过氧化氢酶 突变率降低 加入酶抑制剂 KCN 突变率升高 许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株 互变异构效应 机制 A T C G 四种碱基的第六位上如果步是酮基 T G 就是氨 基 C A T 和 G 会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现 而 C 和 A 则会以氨基或亚氨 基两种互变异构的状态出现 由于平衡一般趋向于酮式或氨基式 因此 在 DNA 双链结构中一 般总是以 A T 和 C G 碱基配对的形式出现 可是 在偶然的情况下 T 也会以稀有的烯醇式 形式出现 因此在 DNA 复制达到这一位置的瞬间 通过 DNA 聚合酶的作用 在它的相对位置 上就不再出现常规的 A 而是出现 G 同样 如果 C 以稀有的亚氨基形式出现在 DNA 复制达到 这一位置的刹那间 则在新合成 DNA 单链的与 C 相应的位置上将是 A 而不是 G 碱基对发生自发突变的几率约位 10 8 10 9 环出效应 即环状突出效应 有人提出 在 DNA 的复制过程中 如果其中某一单链上偶 然产生一个小环 则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失 从而造成自发突变 七 紫外线对 DNA 的损伤及其修复 已知 DNA 的损伤类型很多 机体对其修复的方式也各异 发现较早和研究较深入的是紫外 线 1 紫外线的作用机制 紫外线的主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体 二聚体的 出现会减弱双链间氢键的作用 并引起双链结构扭曲变形 阻碍碱基间的正常配对 从而有可能 引起突变或死亡 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少 但一旦形成 就会妨碍双链的解开 而影响 DNA 是复制和转录 并使细胞死亡 微生物能以多种方式去修复损伤后的 DNA 主要有以下几种 2 DNA 损伤的修复 1 光复活作用 定义 把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时 可明显降低其死亡率的现象 称为光复活作用 机制 光激活酶 光裂合酶 光复活酶 的作用 黑暗中 光复活酶与带有胸腺嘧啶二 聚体的 DNA 分子结合 当暴露于可见光下时 光复活酶因获得光能而发生解离 从而使二聚体 重新分解成单体 而此同时 光激活酶从复合物中释放出来 得以再生 应用 紫外线诱变育种时 为避免光复活作用 只能在红光或黄光下进行照射及处理照 射后的菌液 2 暗修复作用 又称切除修复 是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂损伤后的 DNA 的机制 与光全然无关 机制 P242 四种酶的协同作用 核酸内切酶 核酸外切酶 DNA 聚合酶 连接酶 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 10 二 突变与育种二 突变与育种 一 自发突变与育种 1 从生产中选育 在日常的大生产过程中 微生物也会以一定频率发生自发突变 据此选 育优良的生产菌种 如 从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的自发突变株 缺点 盲目性 几率小 除形态突变和抗性突变外 难发现 2 定向培育优良品种 1 定向培育 利用某一特定因素长期处理某微生物的群体 同时不断地对它们进行移种 传代 以达到累积并选择相应的自发突变株的目的 2 优 缺点 一种古老的育种方法 由于自发突变的频率较低 变异程度较轻微 所以 用此法培育新种的过程一般十分缓慢 带有守株待兔的被动状态 除某些抗性突变外 其它的性 状无法使用或需要相当长时间 3 例子 梯度平板法 筛选抗代谢物拮抗物的突变株 二 诱变育种 1 定义 利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群 促进其突变率显著提高 然后采用简便 快速和高效的筛选方法 从中挑选出少数符合育种目的的突变株 以供生产实践 或科学实验之用 有诱变和筛选两个环节 其中筛选环节更重要 2 优点及实践意义 诱变育种不仅能提高代谢物的产量 还可以改进产品质量 扩大品种和简化生产工艺等 从方法上来说 简便易行 工作进度快 收效显著 实践意义 当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株 几乎毫无例外地都是通 过诱变育种而明显提高其生产性能的 典型例子 青霉素生产菌 最初的 100 个单位通过育种提 高到了 5 10 万个单位 3 诱变育种的基本环节 诱变育种的基本环节很多 且常因工作目的 育种对象和操作者 的安排而有所差异 但基本环节雷同 以最常用的高产突变株的选育为例 绝大多数死亡 出发菌株经诱变 多数未变 少数存活 多数负变 少数突变 多数幅度小 少数正变 多数不宜投产 少数幅度大 少数宜投产 存活率 突变率 正变率 高产率 投产率 4 诱变育种工作中应考虑的几个原则 1 挑选优良的出发菌株 选择合适的出发菌株 可以提高育种的效率 目前的育种工作中 只是参考一些实际经验来 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 11 选用出发菌株 如 最好是经过生产中选育过的自发变异菌株 采用具有有利性状是菌株 如生长速度快 营养要求低 产孢子量早而多的菌株 选择已发生其他变异的菌株作出发菌株 因为有些菌株在发生某一变异后会提高对其他 诱变因素的敏感性 选择增变菌株 对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高 在选择产核苷酸或产氨基酸的出发菌株时 最好选择至少能累积少量所需产物或其前体 的菌株 选择产抗生素菌株时 最好选择已通过多次诱变且每次的效价都有所提高的菌株作出发 菌株 2 选择简便有效的诱变剂和诱变方法 诱变剂的选择 坚持安全第一的原则 诱变剂都有强烈的 三致 作用 致突变 致畸 变 致癌变 最常用诱变剂 紫外线 最常用 射线 DES 硫酸二乙酯 N 甲基 N 硝基 N 亚硝基胍 NTG 甲基磺酸乙酯 EMS Ames test 艾姆斯试验 测定化学物质的潜在致癌性 基本原理 P247 可疑 三致 试样 保温 吸入滤纸片 置于含鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸缺陷型菌 鼠肝匀浆 含羟化酶等 培养 平板上无大量菌落产生 不含诱变剂 株的基本培养基上 有一抑制圈 其外有大量菌落 诱变剂 浓度很高 纸片周围即有大量菌落 诱变剂 浓度适当 说明 A 诱变剂使菌株发生回复突变 从而能在基本培养基上生长 B 有些物质本身并非诱变剂 进入动物体后经过生物化学修饰才变成诱变剂 前诱变 剂 鼠肝提取物中含有一些酶类 如羟化酶等 能使前诱变剂变为诱变剂 应用 艾姆斯试验已广泛用于检测食品 饮料 药物和饮水等试样中的致癌物 快速 3 天 左右 准确 检测致癌物的符合率 85 费用省 采用简便的诱变方法 紫外灯 15W 30cm 照射时间 10 20 秒 10 20 分钟 简易处理方法 平板表面涂一层出发菌株细胞 平板上均匀地放几颗小的诱变剂颗粒 或吸 有诱变剂溶液的滤纸片 经培养后 在制菌圈的周围挑取若干突变菌落 分别制成菌悬液 然 后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落 最后用影印培养法或逐个检出法选出突变株 3 处理单孢子 或单细胞 悬液 在诱变育种中 所处理的细胞必须是单细胞 均匀的悬液状态 原因如下 一是分散状 态的细胞可以均匀地接触诱变剂 二是可避免长出不纯菌落 表型延迟 phenotypic lag 虽已处理单核的细胞或孢子 但由于诱变剂一般只作用于 DNA 双链中的某一条单链 故某一突变还是无法反映在表型上 只有当经过 DNA 的复制和细 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 12 胞分裂后 这一变异才会在表型上表达出来 于是出现了不纯菌落 这叫表型延迟 霉菌 放线菌 处理孢子 芽孢杆菌 处理芽孢 细胞的生理状态 对诱变效果也会发生很大的影响 细菌一般以指数期为好 霉菌或放 线菌的孢子稍加萌发后可提高诱变率 4 选用最适剂量 剂量的表示 不同的诱变剂有不同的表示方式 一般用强度和作用时间的乘积来表示 化学诱变剂 一般以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示 在育种实践中还常以杀菌 率来作诱变剂的相对剂量 合适剂量的确定 需经多次试验 以下几个原则供参考 一般而言 突变率随着剂量的增高而提高 但达到一定程度后 反而会使突变率降低 正变多出现在偏低的剂量中 而负变较多地出现于偏高的剂量中 多次诱变而提高产量的菌株中更容易出现负变 目前育种工作中比较倾向采用较低的剂量 杀菌率 70 75 甚至更低 30 70 的相对剂 量 5 充分利用复合处理的协同效应 synergism 诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应 对育种工作很有参考价值 复合处理有几类 两种或多种诱变剂的先后使用 同一种诱变剂的重复使用 两种或多种诱变剂的同时使用 6 利用和创造形态 生理和产量间的相关指标 提高筛选效率 这一点很重要 选择好 可以大大提高筛选效率 在诱变育种工作中 常常有大量的突变株需要检测 必须进行大量的分析测定和统计工作 如果能找出形态 生理与产量间的关系 就可节省大量的筛选工作 通常所用方法是 利用鉴别性培养基或其他方法把原来肉眼所观察不到的生理状态或产量性 状转化为可见的 形态 性状 常见的有 蛋白酶水解圈的大小 淀粉酶变色圈 用碘液使淀粉 显色 大小 氨基酸显色圈的大小 柠檬酸变色圈的大小 抗生素抑菌圈的大小等 7 设计或采用高效筛选方案或方法 通过诱变处理 会出现各种突变型 但其中绝大部分是负变菌株 要在其中把极个别的产量 提高较显著的正变菌株筛选到手可能要比沙里淘金还难 为了花费最少的工作量 又能在短时间 内取得最大成效 就要努力设计或采用高效率的科学筛选方案和具体的筛选方法 筛选方案 一般采用初筛和复筛两个阶段 前一阶段以量为主 后一阶段以质为主 常 见的一种筛选方案 工作量限度为 200 个摇瓶 第一轮 一个出发菌株 诱变剂处理 选出 200 个 初筛 选出 50 株 复筛 选出 5 株 单孢子菌株 每株 1 瓶 每株 4 瓶 第二轮 40 株 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 13 40 株 5 株 诱变 40 株 初筛 选出 50 株 复筛 选出 5 株 40 株 每株 1 瓶 每株 4 瓶 40 株 这样通过较少的工作量得到较好的菌株 而且还可使眼前产量不高但有发展前途的菌株不漏 选 筛选方法 一般也通过初筛和复筛两种方法对突变株进行生产性能的测定 初筛方法有平板培养和摇瓶培养两种 主要是对生产性能作粗略检测 平板培养优点 快速简便 工作量小 结果直观性强 缺点 与摇瓶培养 发酵罐培养相比 条件差别较大 摇瓶培养优点 与发酵罐条件接近 结果准确 缺点 需要较多的劳动力 设备和时间 复筛方法 常用摇瓶培养进行 对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作 具体筛选方法有多种 需根据实际情况不断摸索 典型例子 春日霉素生产菌的筛选 琼脂 块培养法 1 营养缺陷型突变株的筛选 1 三类培养基 基本培养基 MM 仅能满足某一种微生物的野生型菌株生长繁殖最低营养要求的组合 培养基 完全培养基 CM 能满足所有营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基 是由 基本培养基加上一些富含维生素 氨基酸等的天然物质 补 充 培 养 基 SM A B 只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基 是由基本培养 基加上某一营养缺陷型不能合成的物质 2 三类遗传型个体 野生型 wild type 从自然界分离得到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始 菌株 均称该微生物的野生型 能在上述三种培养基上都生长 如果以 A B 两个基因来表示其 对这两种营养物的合成能力 则野生型菌株的表型应是 A B 营养缺陷型 auxotroph 野生型菌株经诱变处理后 由于发生了丧失某种酶合成能力的 突变 只能在加有该酶合成产物的培养基上才能生长 B 基因营养缺陷型的表型为 A B 原养型 prototroph 一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株 其营养要求 在表型上与野生型相同 均为 A B 三种遗传型的特点 见教材 3 营养缺陷型的筛选方法 一般要经 诱变 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型四个环节 诱变处理 同一般的诱变处理 淘汰野生型 在诱变后存活的个体中 营养缺陷型的比例一般较低 需要淘汰为数众多 的野生型菌株 浓缩缺陷型菌株 常用的淘汰野生型的方法 抗生素法和菌丝过滤法 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 14 A 抗生素法 青霉素法 适用于细菌 抑制细胞壁的生物合成 杀死生长繁殖的细胞 不杀死处于休止 状态的细胞 MM 青霉素的平板 制霉菌素法 适用于真菌 大环内酯类抗生素 与真菌细胞膜上的甾醇发生作用 引起细 胞膜的损伤 B 菌丝过滤法 适用于丝状生长的真菌或放线菌 原理 在 MM 中 野生型的孢子培养 在 MM 上 再用擦镜纸等合适滤纸过滤 检出缺陷型 具体方法很多 夹层培养法 同一平板上检出 限量补充培养法 逐个检出法 不同平板上对照检出 影印接种法 A 夹层培养法 B 限量补充培养法 限量补充相应物质 在 MM 上野生型菌株长成大菌落 缺陷型菌株长 成小菌落 C 逐个检出法 把经诱变处理后的细胞涂布在平板上 待长成单个菌落后 用接种针或灭 过菌的牙签把这些单个菌落逐个依次地分别接种到 MM 和另一 CM 上 经培养后 CM 上生长 MM 的相应位置上不生长 则为营养缺陷型 D 影印接种法 在 CM 上培养生长 影印接种到 MM 上不生长则为营养缺陷型菌株 鉴定缺陷型 生长谱法 把完全培养液里的营养缺陷型细胞或斜面上的孢子洗下 经用无菌水离心洗涤后 配成浓度 为 107 108个 毫升的悬液 随后取 0 1mL 与 MM 均匀混合 再倒在培养皿上 待平板表面稍干 燥后 在皿背上划若干区域 在平板正面加上微量的氨基酸 维生素 嘌呤或嘧啶等营养物的粉 末或结晶 滤纸片法也可 经培养后 某一营养物的周围有生长圈 说明就是该营养物的缺陷 型 4 营养缺陷型突变株的应用 在基本理论研究 应用研究 生产实践中都有极其重要的意义 科学试验中 作为研究代谢途径和杂交 转化 转导 原生质体融合 质粒和转座因子 等遗传规律所必不可少的标记菌种 作氨基酸 维生素 碱基等物质测定的试验菌种 生产实践中可直接用作发酵生产核苷酸 氨基酸等代谢产物的生产菌株 作为生产菌种杂交 重组育种和利用基因工程育种时所不可缺少的带有特定基因标记发 亲本菌株 CM 三层均为 MM 中间一层含菌 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 15 第三节第三节 基因重组基因重组 1 基因重组定义 把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起 经过遗传分子间的重新 组合 形成新遗传型个体的方式 称为基因重组或遗传重组 重组可使生物体在未发生突变的情 况下 也能产生新遗传型的个体 2 基因重组的方式 原核生物 转化 转导 接合 原生质体融合 真核生物 有性杂交 准性杂交 原生质体融合 一 原核生物的基因重组一 原核生物的基因重组 一 转化 transformation 1 定义 受体菌直接吸收了来自供体菌的 DNA 片段 通过交换 把它整合到自己的基因组 中 再经复制就使自己变成一个转化子 这种受体菌接受供体菌的 DNA 片段而获得部分新的遗 传性状的现象 称转化或转化作用 脱氧核糖核酸酶可抑制转化作用的进行 2 转化的条件 供体菌 一般都可进行 DNA 释放 受体菌 处于感受态 亦即受体细胞容易接受外源 DNA 片段并实现其转化的一种生理状态 大多数菌种在对数期后期 平稳期前期最敏感 CAMP Ca2 等可影响感受态的出现 感受态因子 已知是一种胞外蛋白 这种蛋白质可能是细胞膜上的一种组成 它可以催化外 来 DNA 片段的吸收或降解细胞表面某种成分 以让细胞表面的 DNA 受体显露出来 也可能是 一种自溶酶 3 转化因子 转化因子的本质是 DNA 据研究 呈质粒形式 双链 共价闭合环状 DNA 的转化因子 其转化频率最高 因为它进入受体菌后 可不必同受体菌染色体进行交换 整合即 可进行复制和表达 一般的转化因子都是线状双链 DNA 少数报道认为线状单链 DNA 也有转 化作用 4 转化的过程 5 转染 transfection 如果把噬菌体或其它病毒的 DNA 或 RNA 抽提出来 让它去感 染感受态的宿主细胞 并进而产生正常的噬菌体或病毒后代 这种现象称为转染 它与转化的不 同之处在于 病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌 中间也不发生遗传因子的交换或整合 也不 产生具有杂种性质的转化子 二 转导 transduction 1 定义 通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介 把供体细胞的 DNA 小片段携带到受体细 胞中 通过交换与整合 从而使后者获得前者部分遗传性状的现象 称为转导 获得新遗传性状 的受体细胞 就称转导子 最初由 J Lederberg 在鼠伤寒沙门氏菌中发现的 2 存在 自然界中比较普遍 它在低等生物的进化中 很可能是一种产生新基因组合的重 要方式 3 转导的分类 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 16 1 普遍转导 generalized transduction 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段 的 误包 而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象 称为普遍转导 普遍转导分为以下两 种 完全普遍转导 简称完全转导 完全缺陷噬菌体 完全不含噬菌体自身 DNA 的假噬菌体 称完全缺陷噬菌体 完全缺陷噬菌体导入的外源 DNA 片段与受体细胞核染色体组上的同源区段配对 再通过双 交换而整合到受体菌染色体组上 使后者成为一个遗传性状稳定的转导子 实现完全普遍转导 流产普遍转导 简称转导 abortive transduction 经转导而获得了供体菌 DNA 片段的受 体菌 如果外源 DNA 在其内既不进行交换 整合和复制 也不迅速消失 而进行转录 转译和 性状表达 这种现象叫流产转导 在选择性培养基上形成微小菌落是流产转导子的特点 2 局限转导 restricted 或 specialized transduction 定义 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中 并获得表 达的转导现象 特点 A 只能转导供体菌的个别特定基因 B 该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带 C 缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率 误切 或由于双重溶原菌的裂解而形成 分类 根据转导频率的高低把局限转导分为两类 低频转导 LFT P259 260 高频转导 HFT P260 3 溶源转变 lysogenic conversion 表面上与转导相似但本质上却不同的特殊现象 定义 当温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时 因噬菌体的基因整合到宿主的核 基因组上 而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象 称为溶源转变 溶源转变与转导有本质的不同 A 温和噬菌体并不携带任何来子供体菌的外源基因 使宿主带来新性状的正是噬菌体本身 的基因 B 温和噬菌体是完整的 不是缺陷的 C 获得新性状的是溶源化的宿主细胞 而不是什么转导子 D 获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失 典型例子 白喉棒杆菌不产白喉毒素的菌株 在被 温和噬菌体感染而发生溶源化时 就会变成产毒的致病菌株 三 结合 conjugation 1 定义 供体菌 雄 通过其性菌毛与受体菌 雌 相接触 前者传递不同长度的单 链 DNA 给后者 并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换 整合 从而使后者 获得供体菌的遗传性状的现象 称为接合 通过接合获得新性状的细胞 就是接合子 2 存在 细菌和放线菌中都存在接合现象 3 E coli 的接合现象 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 17 1 F 因子 E coli 中性别决定的质粒 有 F 因子的细胞 表面有性菌毛 根据细胞中是否 有 F 因子及其存在方式的不同 把 E coli 分成四中接合型的菌株 F F Hfr F 2 四种接合型的菌株 F 菌株 细胞中存在游离的 F 因子 1 4 个 细胞表面有性菌毛 F F 2F F 雌性 菌株 细胞中不含 F 因子 表面也没性菌毛 可通过与 F F 菌株的接 合而获得 F 因子或 F 因子 变成 雄 性菌株 Hfr 菌株也可使其变成 雄 性菌株 Hfr 高频重组 菌株 因 Hfr 菌株与 F 菌株接合后发生重组的频率要比 F 与 F 接合后 的重组频率高出数百倍 故名 F 因子在其中的状态不是游离型 而是整合在核染色体组的特定 位点上 F 菌株 当 Hfr 菌株内的 F 因子不正常切离而脱离核染色体组时 可重新形成游离的但 携带一小段染色体基因的特殊 F 因子 称 F 因子 F 菌株 携带了 F 因子的菌株 其性状介于 F 与 Hfr 菌株之间 这就是初生 F 菌株 通 过 F 与 F 菌株间的接合 使 F 菌株变成 F 菌株 这就是次生 F 菌株 四 原生质体融合 protoplast fusion 1 定义 通过人为的方法 使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合 并进而发生遗 传重组以产生同时带有双亲性状的 遗传性稳定的融合子的过程 称为原生质体融合 70 年代 后期才发展起来 2 原生质体融合的主要步骤 A 菌株 去壁 PEG 或电脉冲 稀释 涂皿 B 菌株 高渗下 原生质体 离心 促融 高渗下 各种融合子 再生 影印接种 各种融合子长成菌落 检出融合子 筛选优良性状融合子 去壁 细菌 放线菌用溶菌酶或青霉素 真菌用蜗牛酶 3 特点 重组频率高 可达 10 1 重组范围广 可在种 属 科间融合 可利用失活 灭活 原生质体与有活性原生质体融合 二 二 真核生物的基因重组真核生物的基因重组 真核生物中的基因重组有 有性杂交 准性杂交 原生质体融合 转化等 一 有性杂交 1 定义 杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式 有性杂交 一般指性细胞间的接 合和随之发生的染色体重组 并产生新遗传型后代的一种育种技术 凡能产生有性孢子的酵母菌 或霉菌原则上都可进行 2 例子 酒精发酵酵母 产酒精率高 对麦芽糖和葡萄糖的发酵力弱 面包发酵酵母 产酒精率低 对麦芽糖和葡萄糖的发酵力强 二者通过有性杂交所得的优良菌株 产酒精率高 对麦芽糖和葡 萄糖的发酵力强 一 准性杂交 parasexual hybridization PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 18 1 准性生殖 parasexual reproduction 或 parasexuality 是一种类似于有性生殖但比有性生 殖更原始的生殖方式 它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合 且不以减数分裂的方式 而导致低频率的基因重组并产生重组子 准性生殖常见于某些真菌 尤其是半知菌中 2 准性生殖的主要过程 菌丝联结 形态同 遗传性不同的菌株体细胞 形成异核体 能独立生活 核融合 樟 脑蒸汽 紫外线 高温可提高融合率 体细胞交换 紫外线 射线 氮芥等有促进作用 和 单倍体化 3 准性生殖和有性生殖的比较 P266 4 准性杂交育种的主要步骤 P266 选择亲本 A B A B 强制异合 人工 移单菌落 验稳定性 促进变异 紫外线 射线 氮芥 第四节第四节 基因工程基因工程 70 年代后 基因工程出现 一 一 基因工程定义基因工程定义 是指在基因水平上的遗传工程 它用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质 DNA 大分子提取出来 在离体条件下用适当的工具酶进行切割后 把它与作为载体的 DNA 分子连接 起来 然后与载体一起导入某一更易生长 繁殖的受体细胞中 以让外源遗传物质在其中 安家 落户 进行正常的复制和表达 从而获得新物种的一种崭新育种技术 可以超远缘杂交 二 二 基因工程的基本操作基因工程的基本操作 1 目的基因的获得 三个途