分子生物学-引物设计 基因组提取等.doc

DNA提取1抽取1mL外周静脉血（含ACD-枸橼酸钠0.2mL）2 300400uL血入1.5mLEP管3 加900uLRBC Lysis颠倒混匀，RT10min4 15000rpm，离心3040s，弃上清5 沉淀中加500uLRBC lysis，将沉淀弹起6 加15000rpm离心3040s，弃上清7 沉淀中加50 uL RBC Lysis，将沉淀打成细胞悬液8加300uL WBC Lysis，混匀，RT 15min9 加100uL Protein Precipitation（PP），强烈震荡混匀10 15000rpm，离心3min，将上清转到新EP管11 沿管壁缓慢加入900uL预冷无水乙醇，轻摇至DNA析出12 15000rpm离心1min，弃上清13 沉淀中加入500uL 75%乙醇（乙醇比水更能溶去高盐，提DNA是高盐环境）14 15000rpm离心1min，弃上清15 沉淀RT晾干5min16加入100uLDW或TE溶解DNA备用。Recipe for DNA extracting1红细胞裂解液RBC lysis终浓度mol/L加样量（g）NH4Cl0.1558.29KHCO30.011.0EDTA-Na20.00010.0372H2O1000mL2 白细胞裂解液WBC lysis终浓度mol/L加样量（g）SDS0.1%(w/v)Tris-HCI10mM, PH=8.0EDTA-Na21mM, PH=8.03 蛋白质沉淀剂Potassium Acetate 5MPCR相关Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。1提高退火温度，特异性提高；有的提高退火温度也不行，则提高K+浓度，以提高特异性。商品的PCR Mix 具有广谱性，因此要求高的PCR则不一定好扩。2 文献当中的引物使用前，需在BLAST上对比，以确定引物是否合适。3 PCR条件优化有时候需扩增300bp，而扩增后300bp、100bp都有，即出现了非特异性扩增条带：此时需要a 提高退火温度；b 提高K+浓度；c Touch-down PCR，即梯度PCR：65开始2cycle,2为一梯度，直到552cycle为止，共约20cycle；d 可能引物设计有问题，引物没与BLAST比对，提高保守序列（Hos管家序列）-9对PCR引物同时扩增时，优先扩增小片段，小片段所需引物的量也最少。4 预变性，一般952-3min，943min或4-5min。预变性使得DNA双链迅速完全打开。变性 1min以内（30s）退火，使得引物与DNA链结合，对于15-30bp的引物，30s足够，因此退火时间一般为30s-1min。引物的长度以20-25bp最好。退火温度与引物的碱基含量有关：Tm=4（A+T）+2（C+G），上下引物分别算Tm，上下引物Tm不能差5，否则扩不出来。延伸，70-72，为taq酶的最佳温度。对于扩增片段1kb,每增加1kb，需增加延伸时间2min（对于22kb，则延伸时间则延长到40min）。Cycle，25-35个即可。最后延伸72，10min。5 PCR体系：a dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种等摩尔浓度，20-200mol/L。 b PCR缓冲液Mg2+，K+（50mmol/L）(促taq酶活性)，Tris-HCI（PH8.0）。引物设计原则1 引物长度18-25bp，太长特异性好，但不好扩；太短特异性差。2 G+C含量 G+C含量45%55%，但如果一定要G+C堆里进行扩增，需要G+C buffer，3 3末端与需扩的模板要完全匹配。有人说3T比A好，也不一定。4 引物内部不能有二级结构，引物不能互补。5 需用BLAST进行同源性检验6 5末端可以进行甲基化，乙酰化，荧光标记。引物设计相关1文献找引物，然后通过BLAST比对2 一般来讲质粒进行BLAST后扩增，绝对好扩。但是人类基因组的扩增有些麻烦，可以用的软件有Primer 5.0（丁香园破解版）；NCBI primer-blast(需有基因bank号相对应，不是很好用)；Primer3（在线软件，使用简单，把一定要扩增的序列括号起来即可）3 如果是RT-PCR，扩增cDNA，需要包含内含子DNA，以检查是否有DNA污染。因此对于mRNA的反转录PCR有时候需要知道外显子长度等相关信息。4 PCR产物长度需200500bp。5 Primer3 参数设置： 最小最适最大Tm535563GC455055引物长度2022276 人类基因组信息来源：分子生物学NCBI：可以通过文献查找后，序列比对BLAST；Genbank；在线看临床分子生物学书等；SNP，STR，OMIM（在线孟德尔单基因遗传病的表现、检验、治疗与预防、分子生物学相关信息等？）；NCBI输入locus号Nucleartide基因组外显子、序列等信息均有？7 Primer3：Product Tm不管Product size 200700输入信息最小最适最大Tm535563GC455055引物长度202227 Left为上游引物引物blast8 NCBI blast的使用：NCBIbasic BLAST选择一般Nucleartide blast 引物序列输入点击blast蓝色为完全匹配Max Score分值越高越好， E value分值越低越好如果22个碱基的引物，与非目标基因匹配15个以上，则需要非常小心第一章 BLAST的使用：NCBIbasic BLAST选择一般Nucleartide blast 引物序列输入点击blast以PPAR-gammaC161T位点引物：P1:5-CAAGACAACCTGCTACAAGC-3P2:5-TCCTTGTAGATCTCCTGCAG-3分别输入blast进行比对为例：一、输入P1，点击blast，出现如下结果：Transcripts是转录本的意思，一个基因的转录本可能有多个，该栏目表明P1序列与转录本的比对结果。Genomic Sequence栏是在基因组序列中进行比对的结果。其中NT022517.18是在GRCh37.p2数据库中的结果，而NW001838877.2是在另外一个数据库中的结果。二、点击Max Score栏目下面对应的值，1.如在Transcripts下NM015869.4条目后面的Max Score对应的结果为：上图中，1403代表P1（正义链）于该序列的1403处开始。2. 点击Genomic Sequence下NT022517.18对应的Max score则给出在基因组数据库中P1正义链开始的位置-41925059。三、将反义链输入Blast中，点击NM015869.4条目后面的Max Score对应的结果为：此时在其mRNA序列中从1580位到1599位的序列为P2链的倒转互补序列。第二章 关于SNP一SNP命名规则一般写法是这样: dbSNP后面跟featureID. featureID一般是rs/ss后跟7-8位数字， 比如:rs12345678或者dbSNP|rs12345678以下是老鼠(Mus muculas)的1号染色体上SNP列表格式(部分)：-#taxid chromosome chrStart chrEnd orientation contig cnt_start cnt_stop cnt_orient featureName featureId featureType groupLabel weight10090 1 3007431 3007431 + NT_039169.2 7431 7431 + rs6357429 dbSNP:6357429 SNP C57BL/6J 310090 1 3063273 3063273 + NT_039169.2 63273 63273 + rs6351828 dbSNP:6351828 SNP C57BL/6J 310090 1 3063445 3063445 + NT_039169.2 63445 63445 + rs6365082 dbSNP:6365082 SNP C57BL/6J 310090 1 3064055 3064055 + NT_039169.2 64055 64055 + rs6368438 dbSNP:6368438 SNP C57BL/6J 3-说明：第一个SNP的位置是3007431 - 3007431(也就是只有一个位点)。featureName是rs6357429，featureID是6357429，写作dbSNP:6357429.以下是dbSNP数据库的rs_fasta格式：(以上例中rs6357429为例)：gnl|dbSNP|rs6357429_allelePos=251totallen=501|taxid=10090|snpClass=1|alleles=A/G|mol=genomic|build=116GACAGTCCCC ATCTTTCCAT CATTCTTCTC AGTTTATTCA TACATGTTTT AATTTCCATA GTTTTATTAT GTTCCTTTGGGCTTTTTTTC TGCCCCCCCC CCTTTTTGTG CCTTGTGATT CTTTTTAAGA CTTGTTTATT TGAGAATAGA TAAGCAGGGACTACTTGTGA GCAAAGGCTT TCCCAAGTCA AGCCTACTGG AGGTTCTAGG ATCCATCACT CTAGCCTTTC CTGAGGATTAGGCTTTTCCCRGAGTTGAGTG TAACTTTTTC CATCAGTTTT AATACATTAA GCAGCTTATC TCTGCTTCAT TTTAGAAACC TGTAATCTGTTGCTTTGCCT GCTGTCTGCC CGAGGAACTA CAATTCTAAC ATGCTGTGTT CCTAGTGTAT ATTCTCAGCG GCTTCCAGACAAAGCTGCTT GTTCCATCAG CAGTGCATCC AGTACCTGTT GGTGGTCTAT TAGTAGTCCA CATCAGGTGA GACAGATGGAGTCCTTCTGG说明：gnl: object-type=generaldbSNP: Database namers6357429: dbSNP rs# or ss#allelePos=251: Offset of SNP in sequencetotallen=501: Total length of sequencetaxid=10090: taxIDsnpClass=1: 1:insertion/deletion 2:microsatellite 4:unclassified heterozygous 3:named without allele sequence 5:or no variation 6:.alleles=A/G: List of allelesrs_fasta格式详细说明请看：/snp/00readme.txt二SNP产生功能的机制SNP产生功能的机制目前罕有这方面的综述，但是做SNP的功能性研究的文献和方法层出不穷，NAT GENITIC 上几乎每期都有相关方法学的报道。但是对于具体产生机制我提一下本人的看法，希望大家补充。1.对大多数SNP而言，都由于位于一些非编码区域而不产生明显的功能性影响，此时做SNP功能意义不大。2.启动子SNP研究是做的人最多的，相关实验技术都比较成熟，其产生功能的机制主要是影响TF与启动子的的结合能力从而调控基因的转录。3.编码区SNP有同义和非同义2种，非同义突变