细菌内毒素检查法.doc

细菌内毒素检查法文件编号：QC3 048页 码：6/6质量控制文件检验方法版 本 号：V01禁止复印受控号：细菌内毒素检查法颁发部门： 质量保证部生效日期： 年 月 日分发清单: 质量控制部 责任人起草人审核人审核人批准人部 门质量控制部质量控制部质量保证部质量负责人姓 名签 名日 期1 目的为确保药品检验的准确有效，建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。2 范围适用于细菌内毒素的检查。3 定义与缩写3.1细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。3.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品：除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。3.3细菌内毒素检查用水：系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。4 职责4.1 质量控制部QC人员：负责执行本规程。4.2 QC主管：负责监督本规程的实施。5 内容5.1设备用具5.1.1实验设备：电热干燥箱（250以上）、内毒素凝胶法测定仪（371）、旋涡混合器。5.1.2实验用具：刻度吸管、吸耳球、试管、试管架、封口胶、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、秒表、记号笔、取样瓶、可调微量移液器及配套玻璃吸头。5.2试剂：鲎试剂（其标示值用表示）、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。5.3试验准备5.3.1洗液的配制：称取重铬酸钾200g，用少许热水溶解后，加浓硫酸至5000ml。5.3.2 玻璃器皿的洗涤：将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中泡至少4小时取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲后置适宜的密闭金属容器，迅速置烤箱中。5.3.3除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素：玻璃器皿置烤箱后经250干烤30分钟以上，除去热原。5.4 鲎试剂灵敏度复核试验5.4.1在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EUml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。5.4.2根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制成2.0，1.0， 0.5和0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。取分装0.1mL复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做n管；另外 2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后封闭管口，垂直放入371的恒温器中，保温60分钟2分钟。5.4.3将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或者形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。5.4.4当最大浓度2.0管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（C）。C =antilg (X/n)式中 X为反应终点内毒素浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当C在0.52.0（包括0.5和2.0）时，方可用于细菌内毒素检查，并以为该批鲎试剂的灵敏度。每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。5.5 供试品干扰试验5.5.1按鲎试剂灵敏度复核试验项下每浓度平行管各2管，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0，1.0，0.5和0.25四种浓度的内毒素溶液。用细菌内毒素检查用水和用供试品溶液或其稀释液制成的每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液各做2支阴性对照管。如最大浓度管2.0均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）。Es=antilg (Xs/2)Et= antilg (Xt/4)式中 Xs、Xt分别为细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对为反应终点内毒素浓度的对数值(lg)。5.5.2d 当供试品管和阴性对照管都为阴性，并且Es在0.52.0（包括0.5和2.0）时，实验有效。Et在0.52.0（包括0.5和2.0）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大倍数稀释或采用其他适合排除干扰作用的方法。当鲎试剂、供试品的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时，须重新进行干扰试验。5.6检查法：5.6.1用75%酒精棉球擦拭台面，打开内毒素凝胶法测定仪的开关，使温度恒定在（371）。5.6.2 用75%酒精棉球擦手消毒。5.6.3 内毒素阳性对照溶液的制备：5.6.3.1 取内毒素工作标准1支，用砂轮在瓶颈易折点上部轻轻滑痕，用75%酒精棉球擦拭消毒后开启。5.6.3.2用刻度吸管吸取1ml内毒素检查用水,加入到内毒素工作标准品中，用封口胶封口，置旋涡混合器至少混合15min，作为内毒素标准品溶液。用砂轮在瓶颈易折点处滑痕，用75%酒精棉球擦拭消毒后开启。再从中取出适量，逐步稀释成2.0浓度的内毒素溶液，作为内毒素阳性对照溶液。5.6.4 供试品溶液的配制：5.6.4.1 供试品的最大有效稀释倍数（MVD）的计算： MVD=CL/ 式中：L为供试品的细菌内毒素限值 C为供试品溶液的浓度，其中当 L以 EUml表示时，C为 1.0ml/ml，当 L以 EU/mg或 EU/u表示时，C的单位为 mgml或 uml。5.6.4.2取供试品适量，加入内毒素检查用水，按最大有效稀释倍数定量稀释成供试品溶液。5.6.5供试品阳性对照液的配制：从前面的内毒素标准品溶液中取出适量，加入适量的供试品溶液，稀释成浓度为2.0浓度的供试品阳性对照液。5.6.6以内毒素检查用水作为阴性对照液。5.6.7 取0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶8支，用砂轮在瓶颈易折点处轻轻滑痕，用75%酒精棉球擦拭消毒后开启,每支中均加入细菌内毒素检查用水0.1ml， 8支鲎试剂安瓶均如此操作。5.6.7.1 向其中2支中各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管。5.6.7.2向其中2支中各加入0.1ml供试品溶液作为供试品管。5.6.7.3向其中2支中各加入0.1ml供试品阳性对照液作为供试品阳性对照管。5.6.7.4向其中2支中各加入0.1ml2.0浓度的内毒素阳性对照液作为阳性对照管。5.6.7.5打开内毒素凝胶法测定仪的盖子，将安瓶中溶液轻轻混匀后，迅速将8支安瓶垂直放入(371)内毒素凝胶法测定仪中，保温(602)分钟。5.6.8结果判断：5.6.8.1将安瓶从测定仪中轻轻取出，缓缓倒转180时，按安瓶内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整，并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。5.6.8.2若阳性对照的2管均为（+），供试品阳性对照的2管均为（+），阴性对照的2管均为（-），试验有效；阳性对照为（-）或供试品阳性对照为（-）或阴性对照为（+）均认为试验无效。5.6.8