生化技术期末复习.doc

第三章 离心技术离心技术：根据一组物质的密度和在溶液中沉降系数不同（浮力不同），用不同离离心力使 其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。应用：分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及 其它的生物学领域,常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。 第一节 离心技术的原理1.离心力：F = ma = m2 rv a 粒子旋转的加速度，v m 沉降粒子的有效质量v 粒子旋转的角速度， v r粒子的旋转半径( cm )2. 相对离心力(RCF) RCF ：实际离心力转化为重力加速度的倍数RCF=F离心力/F重力 =m2r/mg=2r/g g为重力加速度（980.7cm/sec2)若用 = RCF= = n：转子每分钟的转数(rpm)3. 沉降系数(S) S：指单位离心场中粒子移动的速度。 沉降速度 dx/dt S= = 单位离心力 2 x 若用2n/60表示则： 2.1102logX2/X1S= n2 (t2-t1)X1: 离心前粒子离旋转轴的距离X2: 离心后粒子离旋转轴的距离S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。通过分析型离心机可以测得某种悬浮颗粒或生物高分子的沉降系数S20,w常用S值粗略表示大小 16SrRNA S的用途：1、预计沉降时间 2、测定物质分子质量 4.沉降时间Ts第二节离心机的分类和结构 1. 离心机的分类、按工作原理分为制备型（用于分离）和分析、按离心速度分为：普通 6000 rpm，6000 高速离心机 25000rpm，25000rpm，（最大85000rpm，600，000g）3、按特殊用途分为大容量、低温冷冻、立式台式、连续流动式。2. 离心机的结构、转动装置 2、离心转头 、离心管 4、温度控制和制冷系统5、真空系统 6、离心室 7、安全监测系统转动装置：超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。转子：固定角式转子F 水平转子S 垂直转子V 带状转子Z 连续转子C 固定式转子特点：（1）重心低,转速可较高（2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管 的直径; （3）“管壁效应” ：有一定的角度, 在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀, 此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。水平转子特点：（1）转子的重心位置较高 （2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径（3）对于多种成分样品分离特别有效 （4）常用于速率区带离心和等密度离心离心管 离心管主要用塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。管盖有三种作用防止样品外泄：放射性或强腐蚀性的样品防止样品挥发 支持离心管，防止离心管变形 第三节离心分离方法 1.差速离心机 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开,然后将上清液加高转速离心,分离出第二部分沉淀,如此往复加高转速,逐级分离出所需要的物质。注意：可用角式、水平式转头 可用刹车 难以获得高纯度密度梯度区带离心法：将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。2.速率区带离心法 离心前离心管内先装入密度梯度介质,离心后在近旋转轴处(X1)的介质密度最小,离旋转轴最远处(X2)介质的密度最大,但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度,即pm。这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。梯度液起支持介质和稳定剂的作用,避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。 由于pm则S0, 该离心法的离心时间要严格控制,即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带,又要控制在沉淀之前。 此法是一种不完全的沉降,沉降受物质本身大小的影响较大,一般是应用在物质大小相异而密度接近的情况。注意点：严格控制离心时间 pm 事先配成较平缓的连续密度梯度溶液不能用角式转头、只能用水平式转头 不能用刹车3.等密度离心法预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有粒子的密度），样品铺在梯度液顶上或混合,离心开始后, 梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。最后粒子进入到p=m,此时dx/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带。特点：（1）与样品粒子的密度有关（2）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3）转速、温度不变,则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。注意点：离心时间要长 可用角式转头或水平式转头 粒子密度相近或相等时不宜用密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 不能用刹车第四节 梯度溶液的制备梯度材料的选择原则:1、与被分离的生物材料不发生反应。2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密 度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和 pH变化较小。3、不会对离心设备发生腐蚀作用。4、容易纯化,价格便宜或容易回收。5、浓度便于测定,如具有折光率。6、对于分析超速离心工作来说,它的物理性质,热力学性质应该是已知的。常用的梯度材料：糖类: 蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原 无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等 有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅溶胶: 如Percoll。蛋白质:如牛血清白蛋白重水 非水溶性有机物:如氟代碳等 第五节 分析性超速离心1.分析性超速离心的工作原理椭圆形的转子，真空系统，光学系统，摄像系统应用1.测定生物大分子的相对分子重量 2.生物大分子的纯度估计 3.分析生物大分子中的构象变化 第六节 离心操作的注意事项 精密地平衡 选用适合的离心管 转头是离心机中须重点保护的部件转头室内预冷 最高允许转速和使用累积限酶活性浓度单位：临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度。酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。 表示方法：目前在临床化学中，各国学者几乎都习惯用U/L来表示体液中酶催化浓度。近些年来，我国各级临床实验室多已基本使用U/L来表示酶活性浓度。 酶活性浓度单位的计算：目前主要应用吸光系数法进行计算求取酶活性浓度单位。酶活性单位：酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。 国际单位：在特定的条件下，1分钟内使底物转变1微摩尔的酶量为一个国际单位，以IU表示，1 IU=1 molmin-1。 同工酶：有些酶虽然其蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同，但其活性中心的三维结构相同或相似，可以催化相同的化学反应，其本质为由不同基因编码的多肽链，或由同一基因转录生成的不同mRNA所翻译的不同多肽链组成的蛋白质。由于同工酶的分布具有较明显的组织差异，或者在同一细胞内的定位不同，使同工酶检测对不同组织器官的疾病及组织器官损伤的严重程度的评估都具有较大的意义。 血清酶的来源可将血清酶分成血浆特异酶和非血浆特异酶两大类。血清酶的去路 1.肾小球滤过从尿液中排出 2.网状内皮系统清除 3.血管内失活或灭活 第五章 酶动力学酸性磷酸酶的提取纯化及酶促反应动力学研究第一节 酶学基本知识1.酶:是由活细胞合成的,对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的生物催化剂.酶的化学本质:绝大多数的酶是蛋白质,称为酶 具有催化功能的RNA被称为核酶 具有催化功能的DNA被称为脱氧核酶2. 酶的结构和分类酶的组成：单纯酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、酸性磷酸酶等 结合酶：酶蛋白、辅因子（辅酶，辅基）3.酶的特性：A化学本质：蛋白质B高效催化性：C高度特异性：D可调节性：E不稳定性提取纯化过程中酶活性如何保持？器材洁净 纯净水 试剂纯度高 动作温柔 减少泡沫 选择合适的缓冲体系添加物 降温措施冰水浴第二节 酶促反应动力学1.酶促反应动力学的概念：研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述意义：最适条件酶量最少、催化效率最高2. 酶促反应速度的影响因素酶浓度、底物浓度、pH、温度、反应时间、抑制剂、激活剂3. 酶促反应动力学米氏方程：动力学参数：1.反应速度：酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示。V=-dP/dt=dS/dt2.初速度：在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度，用v0来表示。3.最大反应速度 当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示。 4.米氏常数（Km）：酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度动力学的研究内容（一）底物浓度对反应速度的影响（二）酶浓度对反应速度的影响：当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V = K3 E（三）时间对反应速度的影响（四）pH对反应速度的影响（五）抑制剂对反应速度的影响：酶的抑制剂：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。 可逆性抑制：抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制 需激活剂、 （六）激活剂：激活剂：使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。非必需激活剂第三节 蛋白质（酶）的提取和纯化技术实验为什么选择小麦胚芽？1、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)在自然界中广泛分布于植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。2、植物种子中的ACP在发芽时含量最丰富，随芽胚的生长ACP含量会下降。3、选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化ACP，具有来源方便、酶含量高等优点。酸性磷酸酶的性质1、ACP能溶解于稀缓冲液和水中；2、溶于35%饱和度的硫酸铵溶液中3、在57%饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；4、在中性及高温条件下不稳定，在70时相对稳定；5、pH小于6.5时稳定性增加，枸橼酸和乙酸可增加ACP酶溶液的稳定性；6、Mg2+、Mn2+为ACP激活剂，而Pi、Cu2+、Hg2+、Ag2+、Zn2+、Pb2+、NaF、酒石酸盐、草酸盐和甲醛等是ACP的抑制剂。 1.生物材料的选择2.细胞的破碎技术 （一）机械法：1、 研磨 2、 组织捣碎器（二）物理法：1、 反复冻融法 2、超声波处理法3、压榨法4、冷热交替法（三）化学与生物化学方法3.生物大分子的提取技术 A水溶液提取：1、盐浓度（即离子强度）绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为盐溶现象 2、pH值：酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=68范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。 3、温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在05的低温操作 4、防止蛋白酶或核酸酶的降解作用 5、搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。 B有机溶剂提取4.生物大分子的纯化技术 常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法；原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀、电点沉淀、有机聚合物沉淀等）、透析、超滤、冰冻干燥、超离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等 中性盐沉淀(盐析)蛋白质的基本原理：亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀盐析。中性盐的选择：（NH4）2SO4（a）溶解度大：（NH4）2SO4在0时仍有70.6的溶解度 （b）分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75的杂蛋白，纯度提高了四倍。 （c） 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用23mol/L的（NH4）2SO4保存可达数年之久。（d）价格便宜，废液不污染环境。盐析的影响因素 （a） 蛋白质的浓度： 共沉淀作用 通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.53.0相当于25 30mg/mL。（b）pH值对盐析的影响： 远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。 （c） 温度的影响：要求在04下操作，以避免活力丧失。 有机溶剂沉淀法基本原理：降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加加蛋白质溶质分子之间的作用力，而聚集。注意事项 ：1) 部分蛋白质会变性深低温。2) 有助沉淀的因素：蛋白质分子量大、缓冲液 pH 靠近 pI。3) 脂溶性蛋白质的溶解度反而增加盐析与盐溶的区别：盐溶:加盐使蛋白质溶入水溶液中 盐析:加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來5.生物大分子的纯度鉴定技术：等电聚焦电泳、免疫电泳、超速离心、HPLC、酶的比活性酶纯度鉴定指标-酶的比活性：比活性的概念：单位质量的酶活性，以U/mg蛋白质（酶）来表示。是评价纯化效果最经济最实用的方法酶活性测定-定时法：将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，酶促反应开始进行，经过一定时间后，用终止液终止反应，此时酶促反应已经停止，底物和产物将不再变化，测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（-dS/min）或产物生成速度（dP/min），将速度换算为mol/ min便是以国际单位表示的酶活性。 蛋白质测定：定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法、紫外吸收法、 考马斯亮蓝法。第六章 电泳技术电泳技术是根据电荷性质（电荷密度、结合分子大小、等电点、特殊性质的不同分为：普通电泳，PAGE，IEF，免疫电泳，亲和电泳，转移电泳 。第一节 电泳原理一、电泳基本原理电泳：指带电颗粒在电场作用下向相反电极迁移的过程。区带电泳:有支持介质的电泳分离后经染色能显示区带 电泳基本过程：配制缓冲液，准备支持介质，点样，电泳，显带：染色、荧光、放射性自显 影，分析。电泳的基本原理：在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生一定的电场强度（E），带电粒子在电场中受到电场力会向与其极性相反的电极移动。 A带电粒子在电场中的受力情况：1、电场力F：在稀溶液中，F q E（q为带电量）2、阻力F：移动中的分子会受到介质粘滞力即阻力 对于球状分子，F的大小服从Stokes定律：F=6rr是球状分子的半径，是缓冲液粘度，是电泳速度(=d/t，单位可用cm/min) B电泳速度当带电分子匀速移动时，F = F qE = 6r = 电泳速度与电场强度和带电粒子所带净电荷成正比，与分子的大小和介质粘度成反比。 C电泳迁移率（mobility）：即单位电场强度(1V/cm)时带电粒子的迁移速度，是带电粒子的一个特征常数。 m = 也可由 m = 表示 D不同带点颗粒电泳速度差别的原因 ：1、电荷密度 包括了带电量和分子大小= 在同一电场下，介质粘度对不同分子都相同，因此不同分子因q和r不同而被分离。 q ：分子的带电荷量 r ：分子大小q/r：即电荷密度电荷密度不同是不同物质电泳速度不同的最基本原因2、分子形状3、带电量或分子大小单因素决定速度的电泳：等电聚焦电泳完全依赖电荷量不同分离物质十二烷基磺酸钠凝胶电泳完全依赖分子大小不同而分离物质二、影响电泳分离的主要因素：1.颗粒性质：电荷、分子大小、分子形状等2电场强度：E越大，电泳速度越快，但E增大会引起通过电泳介质的电流强度增大造成电泳过程产生的热量增大（1）产热增大带来的不利影响： 样品和缓冲离子扩散速度增加，使样品分离带加宽产生对流，引起待分离物的混合如果样品（如蛋白）对热敏感，会引起变性 引起介质粘度降低、电阻下降等等 （2）E太小的不利影响：越小，电泳时间越长 引起待分离物质扩散增加3溶液性质：（1）缓冲液的pH：缓冲液pH影响待分离物质电泳方向，pH大于蛋白质的等电点，蛋白质带负电荷，其电泳的方向是指向正极；反之则向负极缓冲液pH影响电泳速度pH值距离物质等电点愈远，带电荷量越大，泳速越快（2）缓冲液的离子强度：一般在0.020.2。离子强度过低，则缓冲能力差；离子强度过高，则电泳速度降低 原因：在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力。（3）缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响 4电渗：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动称为电渗影响：电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度电渗方向与待分离分子电泳方向相反，则降低电泳速度5筛孔三、电泳分类（一）按其分离的原理不同分类：区带电泳、自由界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳。（二）按支持介质的不同分类：1纸电泳2. 醋酸纤维薄膜电泳（CAM）3琼脂凝胶电泳（AGE）4聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）（三）按支持介质形状不同分类：1.薄层电泳2.板式电泳3.柱式电泳 （四）按用途不同分类：1.分析电泳2.制备电泳（五）按所用电压不同分类：低、高压电泳第二节 醋酸纤维素薄膜电泳和琼脂糖凝胶电泳一、CAM优点：1.醋纤膜容易商品化2.对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”3.快速省时：因含水少，大部分电流由样品传导4.薄膜透明后能做光密度扫描定量5.适合于血清蛋白、同工酶等缺点：1.含水量少，电泳过程中薄膜较容易干燥 2.分辨率较低二、琼脂糖凝胶电泳优点：（1）电泳速度快，含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳（2）对蛋白质吸附极微（3）介质均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好（4）本身透明可直接用紫外检测仪作定量测定（5）区带易染色，样品易回收，有利于制备 应用：1.分离蛋白质，2.分离DNA、RNA第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳一、聚丙烯酰胺凝胶（PAG） 丙烯酰胺（Acr）或亚甲双丙烯酰胺（bis或b，），两者在催化剂作用下通过自由基催化聚合，生成具有多孔网状结构的凝胶。聚合过程的催化 ：1. Ap-TEMED系统：加入催化剂过硫酸铵Ap以及加速剂四甲基乙二胺TEMED，四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。Ap-TEMED系统的聚合条件：无氧条件：因为氧气可清除自由基影响聚合的因素：1、聚合过程在40-60分钟内完成为合适（20min也可）2、升高温度能加速聚合 3、过量Ap和TEMED会引起烧胶和蛋白带畸变2. 核黄素-TEMED系统：核黄素经光照分解生成自由基，然后催化聚合，一般光照2-3h完成聚合。PAG的浓度和孔径:1.凝胶总浓度 T T=a、b分别为Acr和Bis的克数，m为水或缓冲液体积（ml） （1）T越大，孔径越小，适用于分离小分子的物质 T越小，孔径越大，适用于分离大分子的物质 （2）可采用T为5-15,7.5为标准胶，多数蛋白质能在此浓度得到分离 （3）常将凝胶配成T为30的凝胶单体贮存液2.交联剂Bis的浓度C C=（1）C也对凝胶孔径大小有影响： C4时，孔径最小 C 4时，C越小孔径越大（2）C以3为宜，这种凝胶透明且富有弹性。最常用的C是2.6和3 C大于5时凝胶变脆，不宜使用（3）选择T和C的经验公式是：C = 6.50.3T 适用于T 5-20PAG的优点: 可控制T和C的浓度，从而得到不同孔径的凝胶 具有电荷效应和分子筛效应，电泳分辨率更高 化学上惰性，无电渗作用 单体原料纯，电泳重复性较好 透明度好，便于扫描定量和照相无紫外吸收，无染色即能直接做紫外扫描分析 机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 是在PAG中利用电荷效应和分子筛效应进行的电泳。电荷密度相同的样品组分，分子大小若不同，仍可由分子筛效应而被分离。电泳形式：柱状电泳：PAGE最初是在柱形玻璃管中进行，每管只能做一个样品，各管间有差异。垂直板式电泳：一次可最多可做20个样品，各样品之间重复性好。水平板式电泳：凝胶可以直接铺在冷却板上，电压高，电泳速度快。三、SDSPAGE 特殊试剂：SDS：十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），一种阴离子表面活性剂，可断开分子内和分子间氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。变性蛋白质成一线性分子，并均匀带上一层负电荷。b-巯基乙醇：强还原剂，可断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。 样品处理：在电泳样品中加入含SDS和b-巯基乙醇的样品处理液， 沸水浴中煮35 min，SDS与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚 。原理：蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，使各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。从而消除各种蛋白质本身电荷上的差异，使电场中不同蛋白质按其分子大小不同而分离。 应用：1.未知蛋白分子量测定2. 蛋白质提纯过程中纯度的检测四、连续PAGE和不连续PAGE （一）电泳系统的组成连续PAGE：只有分离胶不连续PAGE：有浓缩胶与分离胶、甚至样品胶 样品胶：T 4，pH 6.8 Tris-盐酸缓冲液 浓缩胶：T 4，pH 6.8 Tris-盐酸缓冲液 分离胶：T 12.5，pH 8.8 Tris-盐酸缓冲液 电极缓冲液：pH 8.3，Tris-甘氨酸缓冲液在浓缩胶、分离胶和电极缓冲液中，凝胶孔径不同、缓冲液pH不同、缓冲液成分不同，故称不连续PAGE。 （二）电泳系统的分离效应：连续PAGE系统：具有电荷效应和分子筛效应不连续PAGE系统：具有电荷效应和分子筛效应以及浓缩效应 浓缩效应指对样品具有浓缩作用，即压缩样品区带，从而能提高分辨率。系统的不连续性表现在以下方面：1.凝胶由上、下两层凝胶组成上层为大孔径的浓缩胶 下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成、各层凝胶的pH不同电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度原理：样品浓缩原理：样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。在浓缩胶的PH值下，Cl-快速迁移，其后形成低电导区而产生较高的E，导致其后离子Gly-加速至两者等速电泳，Pro-粒子少，迁移速度介于两者之间，故聚集在两者之间，被压缩成窄带。分离胶原理：当甘氨酸到达分离胶后，因分离胶中pH值较大（通常为8.8），甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质，甘氨酸和Cl-的界面很快超过蛋白质。这时蛋白质在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，具有电荷效应和分子筛效应，向正极移动。五、梯度凝胶电泳 优点：（1）可同时分离分子量范围较大的蛋白质样品：（2）可分辨分子量相差较小的蛋白质样品：（3）可直接测定天然状态蛋白质的分子量，而不需要解离为亚基 六、等电聚焦电泳(IEF、IFE）IEF：在一种具有pH梯度的电场中，根据样品等电点（pI）的不同而进行不同组分的分离。具有很高的分辨率，可分辨出等电点相差0.01的蛋白质 。（一）pH梯度的建立：由载体两性电解质形成 载体两性电解质：是一系列pI相近的多氨基-多羧基同系物的混合物应用：1. 测定某个未知蛋白质的等电点2. 分辨率要求高的样品分离七、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE) （双向电泳）（一）原理 第一向电泳：通常是IFE 第二向电泳：为SDS-PAGE第四节 其他电泳技术 一、蛋白质印迹二、毛细管电泳CE：指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间电泳速度的差异而实现分离的一类液相分离技术。第五节 电泳仪的临床应用1.血清蛋白电泳2.尿蛋白电泳3.血红蛋白及糖化血红蛋白电泳4.免疫固定电泳5.同工酶电泳6.脂蛋白电泳 第七章层析技术层析技术的特点:1分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质 2可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。层析法 是利用混合物中各组份的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，从而使各组分以不同速度移动而达到分离配合相应的光学、电学和电化学等检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质分类：A按固定相和流动相所处的状态分类：液相层析法和气相层析法B按层析分离机制分类：凝胶层析：固定相为多孔性凝胶，利用各组份的分子大小、形状不同，在凝胶上受阻滞的程度不同而得到分离。吸附层析：固定相是固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。分配层析：固定相为液体，利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。离子交换层析：固定相为离子交换剂，利用各组份与离子交换剂亲和力不同而得到分离。 亲和层析：利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力从而与其他组份相分离。C按操作形式不同分类：柱层析、 用滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，使各组份分离。薄层层析、将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，点样后，用流动相展开，使各组份分离。纸层析、 用滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，使各组份分离。薄膜层析 将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，点样后，用流动相展开，使各组份分离。3基本概念A保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的多少。 用来描述层析峰在层析图上的位置。B分离度： 定量描述相邻两组分在层析柱内分离情况的指标可用峰底分离度、峰半高宽分离度、及峰高分离度不同方式表示峰底分离度等于相邻两组分层析峰保留值之差与层析峰平均底宽之比，是国内外广泛采用的一个分离度指标，用表示分离度愈大，说明分离效果愈好 Rs值越大，两种组分分离的越好当Rs = 1时，两组分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。 C迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值 D分配系数 ：在一定层析法条件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平均浓度的比值称分配系数，用K表示。K =K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程中溶质出现较晚K值小表示某溶质在流动相中浓度大，故在洗脱液中出现较早 若两个相似的K值组分在同一层析条件下具有，则表明两组分层析峰会发生重叠，分离效果差E柱效塔板高度：某一组分随流动相经过一定距离后，流动相中某组分的平均浓度与固定相的平均浓度达到分配平衡，完成这一平衡所需要的层析柱的柱长-塔板高度或理论塔板等效高度。用H表示。理论塔板数(n)：一定柱长(L)中含有多少塔板高度(H)称为理论塔板数(n)n=第二节 凝胶层析凝胶排阻层析 分子筛层析 凝胶过滤 凝胶渗透层析1概述固定相：惰性的珠状凝胶颗粒，立体网状结构当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小外水体积：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积Vo内水体积：凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 Vi基质体积：凝胶颗粒实际骨架体积 Vg柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积Vt 洗脱体积：样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。排阻极限：不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg则有：VtVoViVg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：VtVoVi B分配系数 对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中，分配系数通常表示为：Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)一般Kav值在01之间，C排阻极限：不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量D分级分离范围：表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。E吸水率：1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份床体积：1g干的凝胶吸水后的最终体积。 F凝胶颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（mm）来表示柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关，颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢 ，一般比较常用的是100200目 2.凝胶的种类和性质 A葡聚糖凝胶：由葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。（Sephadex和Sephacryl）B聚丙烯酰胺凝胶：消除办法-采用离子强度略高的洗脱液。 C琼脂糖凝胶 D多孔玻璃珠、多孔硅胶 E聚苯乙烯凝胶3.实验分组分离：将样品中分子量大小相差县殊的两组物质分开分级分离：将一组分子量比较接近的组分分开4、凝胶的选择、处理、保存A凝胶的选择凝胶类型的选择分组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶；一般常用排阻极限较小的凝胶类型 ，分级分离时凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量，另一方面要合适，不能过大凝胶颗粒的选择：颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重，颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果B层析柱的选择：样品量的多少、分辨率的要求层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等。一般柱长度不超过100cmC凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后应均匀、无纹路、无气泡D洗脱液的选择 为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。E加样量 分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的15左右分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的1025。 5、凝胶层析的应用 A生物大分子的纯化 B 分子量测定C脱盐及去除小分子杂质 D去热源物质E溶液的浓缩第四节 离子交换层析1、基本原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的固定相是离子交换剂离子交换剂与水合离子的结合力，跟水合离子的电荷量成正比，与水合离子半径的平方成反比。离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。2、离子交换剂 离子交换剂应满足的基本条件有： 有高度的不溶性 有疏松的多孔结构或巨大表面积 有较多的交换基团 有稳定的物理化学性质。A离子交换剂的种类 根据离子交换