芋头病毒检测技术规程（定稿）

ICS65.020B 16DB37山东省地方标准DB 37/T 芋头病毒检测技术规程Detection and identification of taro viruses - - 发布 - - 实施山东省市场监督管理局 发布DB 37/T 前言本标准由山东省农业农村厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。5芋头病毒检测技术规程1 范围本标准规定了芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的RT-PCR的检测方法。本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 检测对象3.1 芋花叶病毒中文名：芋花叶病毒学名：Dasheen mosaic virus缩写：DsMV分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子呈线状，长度约为750 nm。一般通过蚜虫传播，还可通过机械摩擦传播。感染DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状。3.2 黄瓜花叶病毒。中文名：黄瓜花叶病毒学名：Cucumber mosaic virus缩写：CMV分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径28 nm30 nm。主要由蚜虫以非持久性方式传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。4 主要仪器设备、用具和试剂4.1 仪器设备和用具仪器设备和用具主要有：a) PCR仪；b) 电泳仪；c) 水平电泳槽；d) 凝胶成像仪；e) 高速冷冻台式离心机；f) 纯水仪；g) 万分之一天平；h) 普通冰箱（04）；i) -20低温冰箱；j) -70低温冰箱；k) 磁力搅拌器；l) 高压灭菌锅；m) 可调微量移液器（10 L、100 L、200 L、1000 L、5000 L）；n) RNase-free吸头（10 L、200 L、1000 L）；o) RNase-free离心管（1.5 mL、2.0 mL）；p) RNase-free PCR反应管。4.2 试剂所有实验用试剂均为分析纯；相关试剂配制方法详见附录A；除特殊说明外，均为符合GB/T 6682，实验用水为无菌超纯水或去离子水。4.2.1 RNA提取试剂：a) 多糖多酚植物RNA提取试剂盒或其他等效产品；b) 三氯甲烷；c) 异丙醇；d) 75%乙醇；e) RNase-free超纯水。4.2.2 反转录试剂：a) 随机引物；b) RNase抑制剂；c) 逆转录酶：AMV或其他等效酶；d) dNTPs（10 mM）；e) -20C贮藏。4.2.3 PCR试剂：a) DNA聚合酶试剂盒：2Es Taq MasterMix或其他等效产品； b) DNA分子量标记物：100 bp2000 bp；50TAE缓冲液；c) 核酸染料：Gelred（10000）溶液或其他等效溶液；d) 含10-4倍浓度 Gelred的1%琼脂糖凝胶；e) 6DNA上样缓冲液。5 RT-PCR检测方法5.1 方法提要芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为RNA病毒，利用TransZol Plant多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行RNA纯化，然后进行RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。5.2 样品采集观察芋头叶片是否出现叶脉褪绿、脉间褪绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状，取出现上述症状的样品装至无菌样品袋中，标记样品编号、取样时间、取样地点，于低温条件下（28）运送至实验室，放置-70超低温冰箱保存备用。样品避免反复冻融。以通过分子检测不含病毒的样品作为阴性对照，以确定感染DsMV或CMV的样品为阳性对照。以下操作对阴性对照、阳性对照进行同样处理。5.3 RNA的提取和纯化5.3.1 称取100 mg样品置2 ml离心管中，用液氮速冻后迅速研磨，然后加入1 mL裂解缓冲溶液（1 mL /100 mg样品），剧烈振荡混匀，室温放置5 min；4，13000 rpm离心5 min。5.3.2 取上清液于1.5 mL离心管中，加等体积的缓冲液2，颠倒混匀后加入1/4体积三氯甲烷，再次颠倒混匀，室温静置2 min3 min。4，13000 rpm离心10 min。5.3.3 将上层水相转入新的1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。4，13000 rpm离心10 min。5.3.4 弃上清液，加入1 mL预冷的75乙醇，洗涤沉淀。4，13000 rpm离心5 min。5.3.5 重复上述步骤一次，彻底洗净残留盐分。5.3.6 弃上清液，室温晾干，加适量RNase-free H2O溶解。用紫外分光光度计测定RNA浓度。放置-80备用。5.4 引物合成依据文献报道引物序列进行合成（DsMV：Reyes et al.，2009；CMV：姚明华等，2009）。引物配制成10 mol/L储存液备用。表1 RT-PCR检测的引物序列检测病毒引物序列扩增片段大小/bpDsMV正义引物：5-AGGTTGTATTGCAGGCAGATG-3反义引物：5-GCCAATAACTGTGGCCTGTT-31034CMV正义引物：5-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3反义引物：5-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-37775.5 检测5.5.1 反转录合成cDNA第一链取纯化的RNA合成cDNA第一链，反应体系为25 L，各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整，反应体系成分见表2。将上述试剂依次加入RNase-free离心管中，混匀后，放置于42恒温水浴中1 h后，转入72恒温水浴5 min，用于RT-PCR扩增或置-20以下冰箱备用。表2 反应体系成分表成分用量RNA1.0 gdNTP（10 mM each）5.0 L随机引物 （10 mol/L）2.0 L5Reverse Transcriptase Buffer5.0 LRNase抑制剂1.0 LAMV 逆转录酶（10U）1.0 LRNase-free H2O补足25.0 L5.5.2 PCR反应5.5.2.1 反应体系取合成的cDNA第一链进行RT-PCR反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以水代替模板作为空白对照。反应体系成分见表3。表3 反应体系成分表成分用量2Es Taq MasterMix25.0 L正义引物（10mol/L）2.0 L反义引物（10mol/L）2.0 LcDNA2.0 LRNase-free H2O补足50.0 L5.5.2.2 反应程序将上述反应成分混合好后，放置PCR仪进行反应，反应程序参数见表4。表4 反应程序参数步骤温度时间预变性942 min变性9430 s35个循环退火5630 s延伸721 min终延伸725 min5.5.3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测将50TAE电泳缓冲液稀释成1TAE电泳缓冲液，制备1%的琼脂糖凝胶。取上述PCR产物10 L，加入上样缓冲液（终浓度为1），混匀后移入胶孔，并在样品孔一侧加入DNA分子量标记。电压大小根据电泳槽长度确定，一般控制在3 V/cm5 V/cm，当溴酚蓝指示带移动到凝胶2/3处时关闭电源。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性条带，拍摄并记录。6 结果判定及表述6.1 结果判定6.1.1 阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带（芋花叶病毒：1034 bp；黄瓜花叶病毒：777 bp），待测样品未出现预期大小的扩增条带，则可判断样品为阴性。6.1.2 阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照及待测样品出现与所测病