乙肝病毒诱导IIA型磷脂酶A2表达的分子机制研究.docx

1.1 研究意义原发性肝癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、生存期短。我国是世界上HCC死亡率最高的国家，占世界上肝癌总死亡人数的53%。全球每年新患肝癌患者中约55发生在我国，约有30多万人被诊断为HCC，且肝癌发病率和死亡率有逐年升高的趋势，因此，我国的肝癌诊治形势十分严峻1-3。目前乙肝病毒（HBV）是公认的HCC主要诱因之一，HBV感染机体后能够引发慢性乙型肝炎（CHB），最终发展成为肝纤维化（LC）和HCC。HBV编码的病毒蛋白在诱发肝癌形成过程中发挥了至关重要的作用，然而其分子机制不明。HBV编码病毒蛋白如何调控宿主基因的表达并在HBV致HCC中发挥的作用是目前研究的核心问题4,5。因此，揭示在HBV致HCC中发挥关键作用的因子，并探讨HBV病毒蛋白调控其表达的分子机制，将可能为HBV相关HCC治疗提供有效的干预靶点。在前期研究中，我们采用基因芯片筛选了整合HBV全基因组的HepG2.2.15细胞及其对照细胞HepG2的差异表达基因，发现IIA型磷脂酶A2（PLA2G2A）的表达水平在HepG2.2.15细胞显著升高，并且采用RT- PCR和western blot对芯片结果进行了验证，血清学检测结果显示慢性乙肝患者PLA2G2A血清学水平较健康对照高。同时,证实了PLA2G2A能够促进HBV的复制（见工作基础）。由于PLA2G2A在肿瘤多种恶性生物学表型调控（增殖、恶性转化、血管生成、侵袭等）中发挥重要作用6，我们进一步采用基因芯片筛选了HBV相关肝癌组织及癌旁组织中差异表达基因，发现PLA2G2A的表达在癌组织显著上调；临床标本检测结果显示HBV相关肝癌组织中PLA2G2A表达较相应癌旁组织高。然而，HBV是通过哪个病毒蛋白调控PLA2G2A的表达？其调节的信号通路如何？PLA2G2A又如何参与HBV相关肝癌的发生和发展？目前国内外还没有相关报道。本研究将阐明HBV病毒蛋白在转录水平调控PLA2G2A表达的分子机制及PLA2G2A对 HBV致 HCC形成及其恶性表型的影响。研究结果不仅有助于完善HBV调控宿主信号网络分子机理，同时为肝癌的临床诊断、潜在的分子靶向治疗及预后判断提供新的思路。1.2国内外研究现状及发展动态分析1.2.1 HBV是导致 HCC形成的最主要因素全球超过20亿人感染HBV，每年估计有32万人死于HBV相关疾病，大约有30-50%的HBV死于HCC7,8。临床研究表明：慢性HBV感染者的HCC发病危险性要比无HBV感染的普通人群高出 200倍9。我国肝癌病例 80%以上是慢性乙肝患者。由此可见：HBV感染是引起HCC肝癌高发病率的主要危险因素。HBV病毒感染导致HCC 的发生是一个多因素、多阶段的复杂过程，主要包括宿主和病毒两方面的因素。如下图所示。HBV感染诱发HCC的可能机理（Nat Rev Cancer.2006 Sep;6(9):674-687）1.2.2 HBV编码病毒蛋白在肝癌形成中的作用已知 HBV 基因组包含四个开放阅读框（ORF），编码七个病毒蛋白，包括：包膜蛋白基因（preS1/HBx/S-ORF）编码的三个表面抗原（preS1,HBx,HBs）；衣壳蛋白基因（preC/C-ORF）编码的核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg）；聚合酶基因（P-ORF）编码的带有反转录酶功能的聚合酶蛋白（HBp）；由 X基因（X-ORF）编码的 X蛋白（HBx）10。HBV编码的病毒蛋白在肝癌的形成过程中发挥着重要作用。Chisari FV 和Hildt E通过HBx、HBs转基因小鼠，发现在20个月内自发形成 HCC，充分证明了病毒蛋白在 HCC形成中的重要作用11,12；由于HBV转基因鼠天然免疫耐受，在不经历慢性炎症的情况下自发形成HCC，首次提出了HBV编码病毒蛋白能直接诱导HCC形成的假说13,14。HBx通过激活细胞生长信号通路，如 Wnt/beta-catenin 和 Ras/Raf/MAPK，促进肝细胞恶性转化和增殖15；HBs 及其截短体蛋白在内质网堆积，导致内质网应激反应过度，形成氧自由基，致使基因组 DNA 不稳定，从而促进肝癌的形成16；HBc 通过抵抗 TRAIL诱导的肝细胞凋亡，促进肝细胞增殖17。目前为止，HBV致HCC的机制还不是很清楚。因此，阐明HBV编码病毒蛋白如何调控宿主基因的表达及其在致HCC中发挥的作用将对于揭示HBV的致癌机理有着重要意义，同时也将为HCC的治疗提供新的干预靶点。1.2.3 IIA型磷脂酶A2的研究进展磷脂酶A2（PLA2）是一大的酶类，能催化水解磷脂Sn-2位脂键，产生自由脂肪酸和溶血磷脂，在脂类代谢及合成多种生物活性的物质如花生四烯酸、前列腺素、白三烯、血栓素等生理病理过程中发挥重要作用，广泛参与了生物体内多种重要生理和病理过程18。PLA2G2A是PLA2的成员之一，属于分泌型蛋白，其相对分子质量大小约为13kDa15kDa，由122个氨基酸残基组成，有7对二硫键，结构稳定。它广泛存在于哺乳动物的多种组织中，如肺、胸腺、肝、肾脏、前列腺、肠、胎盘、关节滑液和血液等。PLA2G2A与炎症反应、免疫反应、抗血栓形成、细胞增殖、缺血性损伤及变态反应密切相关19。近年来有研究表明，PLA2G2A与某些肿瘤的发生和发展有密切关系，如前列腺癌、消化道肿瘤、肺癌和胃癌等，这引起了肿瘤研究领域的广泛关注6。Jiang等利用免疫组化的方法检测了74例前列腺组织、79例前列腺上皮瘤变和78例前列腺癌中PLA2G2A的表达情况，发现前列腺癌和高分化的上皮瘤变中PLA2G2A表达高于低分化的上皮内瘤变和正常前列腺癌组织20。Kashiwagi等采用Northern blot和免疫组化检测58例胰腺癌患者术后标本和正常对照PLA2G2A的表达情况，结果显示PLA2G2A在65%胰腺癌中高表达，而在正常组织中仅存在于部分腺泡和导管细胞中21。在结直肠癌中，Avoranta等发现，PLA2G2A在恶性结直肠肿瘤含量显著低于直肠腺瘤22。Dong等证实PLA2G2A在肺癌组织表达升高，且其表达水平与肿瘤分级及预后密切相关，PLA2G2A表达高的肺癌患者预后更差23。PLA2G2A可以刺激肿瘤细胞的生长，其产物花生四烯酸导致前列腺肿瘤细胞增殖，促进肿瘤血管生成和转移24。与之相反，PLA2G2A基因沉默的胃癌细胞的侵袭能力增强，且高表达PLA2G2A的胃癌患者5年生存率明显提高25。目前为止，PLA2G2A在肝癌发生和发展中的生物学功能尚未有研究。前期的工作中我们采用基因芯片筛选了慢性HBV患者肝癌组织及其相应癌旁组织的差异表达基因，发现PLA2G2A在癌组织中较癌旁组织高，提示PLA2G2A可能在 HBV致 HCC形成中发挥重要作用，然而，PLA2G2A在 HBV相关癌组织中表达上调的机制及其在肝癌发生发展中的作用尚不清楚。HBV诱导的PLA2G2A表达是通过哪个病毒蛋白发挥作用？其调节机制如何？PLA2G2A在HBV诱发肝癌发生和发展过程中如何发挥作用？尚待进一步研究。1.3 本课题的假设综合分析我们前期工作，发现：HBV能够上调PLA2G2A的表达，慢性乙肝患者PLA2G2A血清学水平较健康对照高，PLA2G2A促进HBV的复制；HBV相关肝癌组织中PLA2G2A表达显著高于癌旁；PLA2G2A促进细胞集落的形成，提示PLA2G2A可能参与了HBV致HCC的形成（见工作基础部分）。根据以上初步实验结果，不难发现一个非常有趣的相互关系网，即：HBV感染引起肝细胞内异常表达某些特定细胞因子和胞内蛋白，如PLA2G2A等，而这些特定蛋白与肝癌的形成和发展存在一定相关性，并且其中一些蛋白（如PLA2G2A）的异常表达又会促进HBV在细胞内的复制水平，两者形成一种正反馈调节关系。如下图。与此类似的两个或多个因子正反馈调节促进组织生长或疾病发生已有报道。Ansel 等于2000年提出了著名的淋巴滤泡生成正反馈调节假说认为：BLC（B-lymphocyte chemoattractant）与membreane lymphotoxin 12正反馈促进淋巴滤泡生成和成熟27。因此，我们根据已有理论和初步实验结果，提出了HBV感染与PLA2G2A异常表达之间这种“正反馈调节”诱发HCC的假说：HBV可能通过诱导某些细胞因子和蛋白（如PLA2G2A）的异常表达来参与肝细胞多种恶性生物学表型的调控,而PLA2G2A的异常表达又将促进HBV在肝细胞内的复制21,这种“正反馈调节”可能是HBV诱发HCC的机制之一。1.4 本项目相关研究在前期工作基础上，本课题拟：通过ELISA，免疫组化、RT-PCR和western blot等实验检测PLA2G2A在HBV相关疾病中的表达，分析其与疾病进程，病理分期和预后的相关性；通过截短和定点突变的萤光素酶报告基因实验、凝胶电泳迁移实验（EMSA）、染色质免疫共沉淀(CHIP)实验等检测病毒蛋白激活的信号转导途径和诱导入核的转录因子，探讨HBV病毒蛋白在转录水平诱导PLA2G2A表达的分子机制；通过流式细胞仪分析转染PLA2G2A真核表达载体后细胞周期的影响，检测PLA2G2A超表达对肝细胞的转化能力。研究结果不仅有助于完善HBV调控宿主信号网络分子机理，同时也为临床诊断和治疗乙肝相关肝癌及预后监测提供全新的思路。参考文献1. 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拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法:1 PLA2G2A的表达与乙肝相关肝癌的相关性的研究1.1 PLA2G2A与HBV相关疾病进程的关系（1）收集武汉大学人民医院住院和门诊乙肝患者（包括慢性乙肝患者、肝纤维化患者和肝癌患者）的血清，详细记录病人的病例信息，包括各项体征、生化和血常规检测指标，同时收集健康体检人群的血清作为正常对照组。（2) 采用ELISA检测乙肝患者组和健康对照组PLA2G2A的血清学水平，统计学软件SPSS16.0分析各组人群PLA2G2A水平的差异，p0.05为有显著性差异。1.2 PLA2G2A与病毒蛋白表达的相关性收集武汉大学人民医院50例乙肝病史患者的肝癌患者癌组织和配对癌旁组织，液氮冻存。（1）RT-PCR和 Western blot分别检测病毒蛋白和 PLA2G2A表达的变化。（2）RT-PCR和 Western blot检测PLA2G2A调控靶基因如HIF-1、P53、MMP-2、 MMP-9和VEGF等表达变化。1.3 PLA2G2A与 HBV致 HCC疾病的相关性收集武汉大学人民医院2005-2015年行肝部分切除术的乙肝相关肝癌患者的病理切片及相关资料。（1）收集石蜡切片，采用免疫组化检测癌组织及其癌旁组织PLA2G2A蛋白的表达情况。（2）分析 PLA2G2A表达与肝癌肿瘤大小、病理分期、临床分期、转移及预后的相关性。2 HBV对PLA2G2A表达的影响及其分子机制研究2.1 HBV对PLA2G2A表达的影响（1）采用RT-PCR和Western blot分别检测PLA2G2A 在L02、 HepG2和HepG2.2.15 (分别代表正常肝细胞、无 HBV感染的肝癌细胞和HBV感染的肝癌细胞) 三种细胞系中mRNA和蛋白的表达水平的差异。（2）构建HBV的感染性克隆pHBV1.3（Zhu et al. 2009,Clin Immunol），将不同浓度的pHBV1.3转染肝癌 细胞系HepG2细胞系，采用RT-PCR和Western blot检测PLA2G2A mRNA和蛋白表达水平的变化。2.2HBV调节PLA2G2A表达的分子机制研究（1）将HBV各个基因分别克隆到真核表达载体pCMV-tag2B（已完成），将HBV单个基因真核表达质粒分别转染 肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02，并设立空载体pCMV-tag2B作为对照，采用RT-PCR和Western-blot 检测PLA2G2A表达水平的变化，确定调控PLA2G2A表达的病毒元件。（2）将PLA2G2A基因启动子(-1145/+22)克隆到含荧光素酶报告基因pGL3-basic。并构建PLA2G2A基因启动子 系列截短（(-1145/+22) PLA2G2A, (-800/+22)PLA2G2A, (-550/+22)PLA2G2A, (-245/+22)PLA2G2A， (-65/+22)PLA2G2A）。将（1）所筛选的病毒元件真核表达质粒分别与PLA2G2A系列截短启动子载体共转 染HepG2和正常肝细胞系L02，报告基因实验检测 PLA2G2A 启动子活性变化，筛选病毒元件调控PLA2G2A 启动子活性的 DNA结合区域。（3）启动子分析软件（/generegulation/McPromoter/）分析该 DNA结合区 域内潜在的转录因子结合位点。（4）分别构建突变了这些潜在转录因子结合位点的 PLA2G2A启动子载体，与（1）中筛选的病毒元件共转染 HepG2和正常肝细胞系L02，报告基因实验检测 PLA2G2A启动子活性变化，筛选出起作用的转录因子结合 位点，从而寻找对应的核转录因子。（5）合成野生型和突变型探针，EMSA和 ChIP实验分别验证筛选出的转录因子与 PLA2G2A启动子上相应位点 是否直接结合。（6）免疫共沉淀（IP）检测病毒元件与筛选出的转录因子是否直接结合；激光共聚焦检测病毒元件与筛选出 的转录因子共定位情况。2.3 病毒元件调节转录因子上游信号通路的筛选将所筛选的病毒元件真核表达质粒转染HepG2和正常肝细胞系L02，给予或不给予信号转导通路的抑制剂（ERK： PD98059； p38：SB203580；JNK： SP600125）。（1）Western blot检测信号通路关键蛋白 ERK、p38、JNK的表达及磷酸化水平的变化；（2）激光共聚焦检测筛选转录因子的入核情况；EMSA检测该转录因子与 PLA2G2A 启动子结合活性的变化；（3）RT-PCR和 Western blot检测PLA2G2A表达变化；报告基因实验检测 PLA2G2A启动子活性变化。3 PLA2G2A转化细胞能力的研究（1）构建PLA2G2A基因真核表达载体pCMV-tag2B-PLA2G2A，将其转染L02细胞和HepG2细胞，并设立pCMV- tag2B作为空白对照，采用流式细胞仪分析转染细胞周期的变化，观察细胞增殖情况，检测PLA2G2A超表 达对L02细胞和HepG2细胞的转化能力。 细胞增殖指数测定：制备单细胞悬液，用碘化丙啶(PI)染色DNA呈红色荧光，异硫氰酸(RITC)染色蛋白质 呈绿色荧光，流式细胞仪分析。采用 Barlogie细胞周期分析法，将处于不同时期的细胞分成3部分，即 G0/G1期、S期和G2M期。细胞增殖指数(PI)按公式PI=(S G2M)/(G0/G1SG2M)100。 细胞增殖性抗原检测：流式细胞术结合单克隆抗体免疫荧光的方法，检测Ki-67和CD71等细胞增殖性抗原 的表达情况（HepG2 细胞作为阳性对照）。（2）软琼脂集落实验检测转染PLA2G2A基因对细胞转化的作用：以未转染的L02细胞为空白对照，以HepG2细 胞为阳性对照，以转染空载体pCMV-tag2B的L02细胞为阴性对照，以转染PLA2G2A基因的L02细胞为实验 组，采用软琼脂集落实验测定PLA2G2A基因的转化作用，初步判定PLA2G2A基因转化细胞的能力。技术路线：图1临床标本检测图2调节机理探讨图3细胞转化实验可行性分析:1项目理论的可行性： HBV感染是公认的诱发HCC因素之一。课题组研究首次发现： HBV能够上调PLA2G2A的表达，且PLA2G2A促进HBV的复制； 乙肝相关的癌组织和癌旁组织的基因芯片筛选结果发现PLA2G2A在癌组织显著升高；RT-PCR和/或Western blot实验验证了基因芯片的结果；PLA2G2A能够促进细胞集落的生成，提示HBV可能通过诱导PLA2G2A表达正反馈促进肝癌形成。本课题的开展是在前期研究基础上的延伸和深入，立论依据充分。2项目方案的可行性：（1）本项目在前期基础上进行实验设计，实验方案合理，层层深入，从不同层面进行探讨，实验目标明确。 流式细胞术、细胞转染及慢病毒载体制备及动物实验等技术均为成熟可靠的技术方法，且已被本课题组 成员所掌握。（2）本项目所需的 HBV 全基因组载体 pHBV1.3，HBV 编码的 7 个病毒蛋白真核表达载体(pCMV-HBx, pCMV- HBs, pCMV-HBx, pCMV-preS1, pCMV-HBc, pCMV-HBe, pCMV-HBp）均已构建完成（Zhu et al. 2009, Clin Immunol），为本课题顺利开展奠定良好的工作基础。3实验设备和临床标本有保障： 课题申请人在攻读博士期间所在实验室为病毒学国家重点实验室，所在学科为国家级重点学科，仪器设备先进齐全，武汉大学人民医院属于国家三级甲等医院，能保障提供与本研究相关的临床样本和病例资料，为课题的顺利实施提供强有力的保障。4课题组成员实力雄厚： 课题组成员长期从事病毒学和肿瘤学的基础和临床工作，熟练掌握了分子生物学和细胞生物学等各项技术，并在国内外权威杂志发表了多篇SCI文章，积累了丰富的科研经验，为本课题的完成提供了可靠的人力支持。3. 本项目的创新之处（1）本课题首次提出HBV诱导PLA2G2A表达正反馈促进肝癌形成的“假说”机制，并通过体内外实验深入而系 统地阐明PLA2G2A在HBV致肝癌中的作用。（2）学科交叉，本课题利用病毒学和肿瘤学的知识， 从病毒蛋白与宿主基因相互作用角度阐明HBV调控 PLA2G2A表达的信号途径，从而探讨HBV致肝癌形成的分子机制，为HBV相关肝癌的诊治及预后判断提供 新的思路。（3）将生物信息学和现代分子生物学相结合，寻找HBV病毒蛋白调控宿主基因的信号通路，将有利于完善HBV 调控宿主信号网路的分子机理。4. 年度研究计划及费用预算2017.1 -2017.6 收集50例乙肝相关肝癌配对的癌和癌旁组织，western blot和 RT-PCR分别检测 PLA2G2A和病毒蛋白表达，分析表达的相关性。2017.72018.6（1）调取病理切片，免疫组化检测大样本乙肝相关肝癌组织中PLA2G2A的表达与肿瘤大小、病理分期、临床 分期、转移相关性。（2）研究PLA2G2A体外转化细胞的能力。（3）研究病毒蛋白调控PLA2G2A表达的不同信号途径。2018.72018.12（2）课题总结、数据分析、撰写论文。5. 预期研究成果（1）理论成果：通过临床标本检测明确 PLA2G2A表达与 HBV相关 HCC疾病预后的相关性；阐明病毒蛋白激活 的信号转导通路，以及诱导入核并结合在 PLA2G2A 启动子上的核转录因子；体内干预实验证实抑制 PLA2G2A表达能显著抑制 HBV致 HCC的形成。通过以上结论有利于加深对病毒蛋白细胞内信号传导通路 以及 HBV致 HCC新机制的理解。（2）论文发表：在国际权威肿瘤学和病毒学杂志上发表论文 3 篇。研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩 本课题组多年来以肝炎病毒等人类重要病毒为主要研究对象，重点研究病毒感染致癌的基础和应用基础研究，包括：乙肝病毒感染致癌的分子机理，乙肝病毒蛋白与肿瘤蛋白相互作用的生物学效应等。（1）采用基因芯片筛选了HepG2.2.15细胞（整合了HBV全基因组）及其对照细胞HepG2、HBV相关的肝癌组织和对应的癌旁组织的差异表达基因，发现PLA2G2A在HepG2.2.15和癌组织中的表达均升高。见表1和表2。表1 HepG2.2.15细胞与HepG2部分差异表达基因表2 HBV相关肝癌组织与对应癌旁组织部分差异表达基因(3) RT-PCR和western blot检测了PLA2G2A 在L02、HepG2和HepG2.2.15 (分别代表正常肝细胞、无HBV感染的肝癌细胞和HBV感染的肝癌细胞) 三种细胞系中mRNA和蛋白表达水平的差异，发现PLA2G2A在HepG2.2.15中的表达显著升高。(图1和图2）。初步完成了3对样品中PLA2G2A 检测。 图3和图4。图1 RT-PCR检测PLA2G2A在L02、HepG2和HepG2.2.15中mRNA表达差异图2 western blot检测PLA2G2A在L02、HepG2和HepG2.2.15中蛋白表达差异注：N代表癌旁组织，T代表癌组织图3 western blot检测了3对HBV相关癌组织和癌旁组织中PLA2G2A的表达图4免疫组化检测HBV相关癌组织及癌旁组织HCC表达差异（4）将不同浓度的HBV感染性克隆pHBV1.3转染HepG2细胞系（Zhu et al. 2009, Clin Immunol），发现HBV能够上调PLA2G2A mRNA和蛋白表达，并且随着pHBV1.3量的不断增加，PLA2G2A的表达