湖北省自然科学基金申请书.doc

.湖 北 省 自 然 科 学 基 金申 请 书项目名称：淹水诱导高效表达玉米启动子的克隆与应用申 请 者：杜何为承担单位:长江大学生命科学学院项目类别：重点项目 一般项目 申请日期：2004年 2月 12日湖北省自然科学基金管理办公室二000年制一、简表研究项目名称淹水诱导高效表达玉米启动子的克隆与应用涉及学科（专业）A名称农艺学B名称作物遗传学C名称代码210代码3020代码主要应用行业（仅重点项目填写）123起止年月2005年1月至2007年12月申请金额4.0万元 承担单位情况第一承担单位名称长江大学生命科学学院通信地址荆州市长江大学西校区生命科学学院办公室邮编434025单位性质A.高等院校 B.科研单位 C.其它 合作单位名称（仅重点项目填写）12承担项目组情况总人数高级中级初级博士后博士生硕士生73112项目负责人姓名杜何为出生年月1976年11月专业技术职称讲师学术带头人是否学位博士硕士学士电-通信地址荆州市长江大学西校区生命科学学院邮编434025其他主要成员情况姓名出生年月专业技术职务工作单位项目中的分工张祖新1964 8副教授长江大学BAC文库的筛选姜华武1965 10副教授长江大学TAIL-PCR扩增及测序魏中一1943 5副教授长江大学生物信息学分析黄敏1975 12助教长江大学Reverse-PCR扩增及测序何勇1979 3研究生长江大学玉米及烟草的遗传转化许锋1979 8研究生长江大学启动子的功能分析研究内容和意义摘 要利用现代生物技术， 克隆玉米淹水诱导高效表达的启动子。该启动子属于诱导型启动子，且具有组织特异性和时空性。通过对该启动子的结构及功能分析，可以阐明玉米早期对淹水响应的分子机理。该启动子对旱生作物的耐渍改良、提高植物对根际病虫害的抗性以及转基因植物的食品安全性等方面，具有十分重要的应用价值。主题词1主题词数量不多于三个；2。主题词之间空一格。玉米(zea mays L.)启动子克隆简 表 填 写 要 求一、 简表内容将输入计算机，必须认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中学科（专业）代码按GB/T13745-92“学科分类与代码”表填写。二、 部分栏目填写要求： 项目名称应确切反映研究内容，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。 学科名称申请项目所属的第二级或三级学科。 申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。 起止年月起始时间从申请的次年元月算起。 项目组其他主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制定理论分析及对项目的完成起主要作用的人员。二、立论依据1 研究项目的科学依据（包括科学意义和应用前景，国内外研究慨况、水平和发展趋势，学术思想，立论依据，特色或创新之处，主要参考文献目录和出处，可另附页）真核生物基因的表达调控是分子生物学研究的热点之一。基因表达的程序、时间和位置在不同的层次上受不同的调节因素控制，这种控制机制不仅决定了基因表达的水平，也决定了基因表达的时空性。转录水平的调控，是基因表达调控最为有效、最为经济的调控，而启动子是基因转录最重要的顺式元件。因此，对启动子进行克隆，从DNA结构了解其生物学功能，并将一些有价值的启动子，如：组织器官特异性、发育调节、淹水诱导启动子的克隆，应用于动植物的遗传改良，是目前分子生物学研究的重要领域之一。启动子（promoter）是指确保精确转录和有效起始的基因5上游DNA序列。启动子的特异序列和结构对基因的转录起着非常重要的调控作用。真核生物的启动子可分为组成型、诱导型和组织特异型三种类型。在组成型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平也没有明显的差异，不表现时空特异性，也不受外界因素的诱导，如 CaMV35S启动子和NOS启动子。在组织特异性启动子控制下，基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特异性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础。例如：马铃薯块茎蛋白基因启动子、胚乳特异性表达基因启动子、果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子、花粉特异性表达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的PAL基因启动子,玉米zein 基因的 P2 启动子(Maier,1990; Twell 1991; Hatton D 1996)，都属于组织特异性启动子。而诱导型启动子是在某些特定的物理或化学信号的刺激下，大幅度地提高基因的转录水平，如热激蛋白基因的启动子（Sato 2001）、植物激素诱导表达基因的启动子（Hattori 1995；http:/rarge.gsc.riken.go.jp/cdna/promoter/）等。这类启动子具有其活化受物理或化学信号的诱导，启动子的分子结构具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，感受特异性诱导的序列都有明显的专一性等特点；该类型有些启动子还具有组织特异性表达的特点。在这三类启动子中，组成型表达CaMV35S启动子在植物转基因系统中被广泛应用，提高抗病、抗虫、品质等外源基因在植物体内的表达水平，改良了植物抗病、抗虫、品质等相关性状。但是，由于这类启动子的特点，外源基因在转化植株的各个部位和整个发育时期均有表达，一是外源基因的过量表达对植株自身的生长发育或多或少有一定的影响；二是当转入的外源基因在人畜食用组织中表达时，人们就会产生食品安全性的担心（Dale 1998；/programs/lifesciences/TransgenicCrops/risks.html ）。为克服组成型表达启动子在应用上的以上不足，在作物转基因体系中，科学家开始设计让外源基因在转基因植株内定向表达，因而，诱导型表达启动子开发和应用成为当前研究的热点。启动子的克隆方法主要有两种策略。其一是从BAC克隆中筛选和序列分析，然后再对基因的5上游DNA序列进行生物信息学分析以确定启动子的特异结构和保守结构域（Nieto-Sotelo 1999；Chatterjee 1997）。如光诱导的rbcs基因启动子（Giuliano 1988）。该策略既可以鉴定启动子，又可以得到基因的组织结构，但是却有赖于BAC文库的构建。其二是使用TAIL-PCR技术从基因组直接扩增启动子。自从Liu（1995，1998）提出TAIL-PCR技术以来，利用TAIL-PCR技术克隆基因5 上游区域的启动子的策略应用日趋广泛。如Terauchi(2000)利用TAIL-PCR技术分离了Pa1和Pgi基因的启动子区域; Ichikawa(1997)利用该技术克隆了人类的WS-3 基因; Tomilov（2001）使用该技术分离了一个控制拟南芥根系发育基因的118bp的DNA侧翼区。同时该方法也被用于T-DNA、Gene trap和转座子插入位点侧翼序列的分离（Qin 2003；Frey 1997；Liu 1995）。该技术不依赖于BAC文库的鉴定，直接利用基因特异性引物和随机简并引物进行PCR扩增，得到基因的侧翼序列，方法简单、快捷，但与前一方法相比，却无法得到基因的内部结构信息，并且受到PCR技术本身的限制，所得序列的长度有限。这两种方法都建立在我们对所要克隆的基因或同源序列有所了解的基础上进行。 本课题组多年来一直致力于玉米耐渍的遗传改良及分子机理的研究，近几年，我们对玉米的耐渍分子机理研究取得了很大的进展。我们已经构建了玉米全生育期的cDNA均一化文库，MO17 SSH 和 HZ32 SSH 正反向文库，我们以淹水处理2h和未淹水的对照RNA分别与芯片杂交，初步探讨玉米自交系MO17对淹水胁迫的早期响应，结果发现了29个3倍差异表达的克隆，测序分析得到21个基因序列，其中上调表达的有16个，下调表达有5个，最高差异71倍。在这些基因中，最令我们感兴趣的是ZmZF基因，该基因在淹水处理2h后增加71倍。通过对ZmZF分析表明，该基因编码一个含233个氨基酸、大约25kD的蛋白质，该蛋白质的N-端有一个UBQ (Ubiquitin homologues) 结构域，C-端则有174氨基酸的锌指结构域，在锌指结构域中有一个39 氨基酸的zf-AN1模体（motif）。基于ZmZF的表达特点和蛋白质的结构特点以及在氨基酸序列上与玉米其他，我们锌指蛋白的同源性分析，我们推测该蛋白质可能与其他响应蛋白基因的表达调控有关。由于ZmZF基因在受淹水胁迫而诱导高效表达，所以，我们有理由推测ZmZF 的启动子属诱导表达启动子。在低氧诱导基因启动子研究上， Dolferus（1994）报道，低氧诱导的启动子区有一厌氧反应因子（ARE），这个ARE在玉米Adh1、Adh2和拟南芥Adh1、Ldh1、Pdc1的启动子中都被发现。在玉米和拟南芥中敲除ARE则无ADH的表达。进一步研究表明，ARE具有特异性GC-motif 和GT-motif，识别各motif的转录因子也具有特异性，GC-motif结合位点为GTT，GT-motif的结合位点为AAC。拟南芥转录因子AtMYB2专一性结合Adh1的GT-motif。厌氧诱导基因的启动子和与之结合转录因子似乎提供了通过调节AtMYB2表达量来调控所有ANPs表达的可能性（Bailey-Serres 1996）。实验证明：CaMV35S-AtMYB2可以在氧正常条件下反式激活ADH1-GUS的表达，说明了低氧胁迫下AtMYB2在前期反应和第二阶段的厌氧反应代谢基因的诱导中起作用,但是AtMYB2是否是ANPs诱导的限制因子还有待研究（Hoeren 1998）。 本研究的目标是克隆一个对低氧胁迫早期响应的、高效诱导性表达基因（ZmZF基因）的启动子。该启动子应具有诱导型启动子的特征。由于淹水早期（2h），该基因在玉米的根部大量表达；正常情况下，在玉米根部及其他组织不表达或表达量极低，当将该启动子控制的外源基因转入到玉米中后，在正常生长条件下，外源基因不表达或低量表达，而当玉米受到低氧胁迫早期时，该启动子受低氧诱导而开放，大量启动外源基因在玉米根系的表达，以响应低氧胁迫（Zhang 2004）。由于外源基因的表达并不涉及玉米子粒等食用组织，并且表达具有时空特性，因此，可以消除人们对组成型启动子的应用所引起的担忧。将构建在该启动子控制下的耐渍相关基因遗传转化体系转化于玉米及其他旱生作物，正常条件下，这些基因不表达或表达量极低，不会影响到玉米及其他旱生作物的正常生长；涝渍条件下，该启动子势必会提高耐渍相关基因在玉米及其他旱生作物中的表达，从而提高旱生作物的耐渍性。因而，对玉米淹水诱导型高效表达启动子的克隆，将为玉米及其他旱生作物耐渍性状的改良，起着十分重要的作用；同时也可用于改良作物对根际病虫害的抗耐性。参考文献：1、 Dolferus R, Jacobs M, Peacock W J, et al. 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Tail-PCR或reverse-PCR引物及接头的合成b. 玉米总DNA的提取c. 对玉米基因组DNA进行完全酶切d. 接头与酶切产物连接e. PCR扩增、扩增产物的回收、克隆及测序f. 对测序结果进行分析，确定启动子的结构及功能区域g. 将所得的启动子与GUS基因连接，构建到转化载体上（对照是将GUS与CaMV35S启动子连接）h. 体外转化试验以确定启动子的功能2.技术路线为保证能够获得ZmZF基因的启动子，我们采取3 套方案平行进行，并对所得结果进行相互验证，具体技术路线如下图。玉米基因组DNA提取TAIL-PCR限制性核酸内切酶消化接头连接PCR扩增序列分析及生物信息学分析ZmZF cDNA玉米BAC文库筛选杂 交启动子+GUS 转酵母启动子+GUS转烟草启动子+VBH转玉米功能分析3.可行性分析1) 长江大学生命科学学院具有分子生物学所需的先进实验设备。2) 本课题组在前期的研究中，已经克隆出ZmZF基因。该基因在玉米苗期淹水处理4-8h后，增强表达71倍，并且只在玉米根系表达，说明该基因有1个淹水诱导高效表达的特异启动子。3) 本课题组初步建立了玉米及烟草的遗传转化体系。4) 本课题组多年来一直从事玉米耐渍性的遗传与分子生物学的研究。在对玉米耐渍性的研究中，我们对玉米的耐渍机理有了初步的了解，并构建了玉米MO17、HZ32的淹水前后的正、反向扣除文库，从中克隆出一些与玉米耐渍相关的基因。这些前期的研究基础，为本研究提供了一定的理论及技术保证。5) 研究队伍以博、硕士为主，年富力强，思想活跃，具有扎实的理论基础和熟练的科研技能，具备完成申请项目的能力。4.理论分析1） 该启动子的克隆及功能分析，拓宽了人们对诱导型启动子的进一步认识。2） 对此启动子的结构及功能分析，可以初步揭示玉米对淹水响应的早期分子生物学机理。3） 该启动子可广泛应用于玉米及其他旱生作物的耐渍遗传改良，提高这些作物的耐渍性。该启动子对提高旱生作物的耐渍性具有十分重要的应用价值。4） 该启动子具有组织特异性和时空性，因此，对非食用根部且非苗期的转基因植物，不存在转基因的食品安全性问题。5） 除了对旱生作物的耐渍遗传改良具有十分重要的意义，该启动子也可用于改良作物对根际病虫害的抗耐性。5.实验总体安排和进度2005年： (1) TAIL-PCR、reverse-PCR扩增及扩增产物的克隆与测序 (2) 筛选BAC文库，并对阳性克隆进行测序 (3) 3种方法所测序列的生物信息学分析，确定启动子的结构及功能区域 2006年： (1) 将克隆出的启动子分别与GUS、VHB连接，构建到转化载体中(2) 使用农杆菌介导法转化玉米及烟草愈伤组织(3) 转化植株的筛选及鉴定2007年： (1) 启动子的功能分析(2) 总结、论文撰写四、研究基础1、实现本项目目标已具备的条件（包括过去的研究工作基础，现有的主要仪器设备、研究技术人员及工作条件，从其他渠道已得到，已申请或拟申请的经费情况及金额等，可另附页） 近年来，本课题组一直从事玉米耐渍性的遗传与分子生物学研究，并开展了玉米转基因的技术体系研究。承担了“玉米耐渍性的遗传分析及耐渍自交系选育”（97A037）、“淹水胁迫下玉米根系细胞程序性死亡与PLD关系研究”（2000B05005）、“玉米转细菌血红蛋白基因的应用研究（2003B001）”的工作，并参与了国家863计划重大课题的部分工作（2001AA222201）。数年来，我们一直致力于玉米耐渍的遗传育种和耐渍形成机理的分子生物学研究，对玉米耐渍形成机理有着独特的见解，并取得了一定的研究成果，获得了多个耐渍性较好的玉米自交系种质资源，为玉米耐渍研究奠定了理论和材料的基础。1.我们已经成功地鉴定出几个耐渍性强的玉米自交系，为玉米耐渍的遗传改良提供了宝贵的育种材料。2.对玉米耐渍性生理生化机制进行了初步的研究，已发表相关学术论文5篇，初步阐述了玉米根系对淹水的响应和“玉米根系在缺氧条件下快速进入乙醇发酵途径和氮代谢途径，提供生存所需能量和减少代谢有毒中间产物积累”等与耐渍性有关的生物学特性。课题组在作物学报、遗传、华中农业大学学报、果树学报、湖北农业科学、玉米科学等学术期刊上发表论文近30篇，积累了丰富的科研经验和研究基础。我们在玉米研究中所取得的初步认识和其他研究者在其他作物研究上所发表的主要成果，为我们开展本课题研究提供了理论指导。3.申请者主持的“玉米转细菌血红蛋白基因的应用研究（2003B001）”课题正在顺利展开，我们将逐步完善玉米遗传转化体系。4.已经获得了与玉米耐渍性有关的35个增强表达和21个降低表达的cDNA片段；同时我们已经构建有玉米全生育期的均一化cDNA文库，MO17 SSH 和 HZ32 SSH 正反向文库，淹水高效诱导表达的基因已克隆。这些研究也为本项目的开展提供了可行的分子生物学方法。5.研究队伍以博、硕士为主，年富力强，思想活跃，具有扎实的理论基础和熟练的科研技能；学科专业结构合理，分工明确，完全具备完成申请项目的能力。6. 拟利用湖北省涝渍灾害与湿地农业省级重点实验室和我校生命科学院实验室，这两个实验室设备先进、齐全，管理科学、严格，具有良好的实验条件和融洽的学术氛围。2、申请者和项目组主要成员业务简历（按人填写主要学历和研究工作简历，近期发表的与本项目有关的主要论著目录和科研成果名称，并注明出处及获奖情况，可另附页）杜何为：男，硕士。1999年于湖北农学院获农学学士学位，2002年于华中农业大学获硕士学位。硕士论文为：玉米转基因体系的研究及转基因植株的检测 ，现承担教育厅青年项目“玉米转血红蛋白的应用研究（2003B001）”，发表学术论文6篇。张祖新：男，硕士，副教授，长江大学生命科学学院玉米课题组学术带头人。曾参与郑用琏教授主持的“西南地区玉米地方种质的遗传多样性及杂种优势模式研究”国家自然科学基金和IFS资助项目研究，获硕士学位。先后主持湖北省教育厅重点科研项目两项，鉴定科研成果一项：“三峡地区玉米地方种质遗传潜势与杂种优势模式研究”，鉴定意见：“达到国内同类研究的领先水平”。主持完成省级科研项目“玉米耐渍性的遗传分析及耐渍自交系选育”（97A037）。鉴定教学研究成果两项，获湖北省教学研究成果二等奖、三等奖各一项。现主持湖北省教育厅科研项目一项、参加国家863重点项目一项。发表的主要学术论文20余篇：(1). 张祖新, 姜华武.玉米杂交种遗传改良的自交系的鉴定.湖北农学院学报,1998,18（3）:193-194(2). 姜华武,张祖新.玉米的厌氧呼吸与耐涝性.湖北农学院学报,1999,19（1）:79-84(3). 姜华武,张祖新.玉米种质的耐涝性鉴定及耐涝性遗传研究初报.湖北农学院学报,1999,19（2）：188-189(4). 姜华武,张祖新.淹水对玉米根系几种酶活性的影响.湖北农学院学报,1999,19（3）:209-211(5). 邹琦主编,张祖新.玉米耐涝性指及其遗传研究.作物栽培与生理研究,北京:中国农业出版社,145-146(6). 张祖新,郑用琏.功能基因组学及其研究方法.作物学报,2002(7). 张祖新,郑用琏.玉米CMS分子生物学研究新进展.遗传,2002(8). 杜何为,张祖新.玉米遗传转化体系的研究.湖北农业科学,2004（已接受）(9). 杜何为,张祖新,郑用琏.玉米组织培养技术体系的研究.湖北农业科学,2003(4):16-21(10).杜何为