生物素亲和素免疫放大技术.doc

第十一章生物素-亲和素免疫放大技术一、生物素-亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素 N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）2.标记蛋白质醛基的活化生物素 酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素 3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素 常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。标记方法：（1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用BHZ。（2）标记酶：以生物素标记HRP为例。标记注意事项：（1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。2.链霉亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC和胶体金。亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1）HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素-生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素-生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。四、生物素-亲和素系统的应用1.生物素-亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术（ABC）。另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记亲和素-生物素法（LAB）。此外，依据待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法BAS和间接法BAS。2.生物素-亲和素系统可用于酶免疫测定、荧光免疫测定等方法中。习题64生物素-亲和素系统（BAS）的特点有A.1个亲和素分子可结合4个生物素分子B.1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C.生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D.亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E.亲和素和生物素有极强的亲和力答疑编号500734110101正确答案A、C、D、编号：Q/ZDJ-SC质 量 手 册第A版章 节00目 录共2页第1页第0次修改第十二章免疫组织化学技术免疫组织化学技术是指组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物。对相应抗原或抗体进行定位、定性或定量检测。其原理仍是抗原抗体的反应，应用酶标记物通过酶与它底物间的组织化学反应生成不溶性颜色产物，用显微镜在细胞或亚细胞水平上观察抗原或抗体的存在、定位及分布。第一节免疫组织化学技术要点一、标本的处理（一）标本主要来源组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡2h以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸检标本中，抗原显示仍较好。组织标本的取材常常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；取材部位必须是主要病变区；必须取病灶与正常组织交界区；必要时取远距病灶区的正常组织作对照。（二）标本的固定与保存为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70冰箱内备用。1.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同。因而对固定剂的耐受性差异较大。如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较差，抗原活性容易丧失。而HBsAg属稳定性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。2.固定剂：用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。（1）醛类固定剂：双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。（2）非醛类固定剂：Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。（3）丙酮及醇类固定剂：系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。选择最佳固定液标准是：最好地保持细胞和组织的形态结构。最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。固定组织时应注意：应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。组织块不易过大过厚，必须小于2cml.5cm0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。3.切片方法的选择：应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5m左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100m，有利于追踪神经纤维的走行。（1）冰冻切片：是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。冰冻时，组织中水分易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33，从-30降至-43之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。（2）石蜡切片：其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：脱水、透明等过程应在4下进行，以尽量减少组织抗原的损失。组织块大小应限于2cm1.5cm0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡。浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度27m，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入37恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象，切片如需长期贮存，可存放于4冰箱内备用。石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用冷冻干燥包埋法，可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空、低温条件下排除组织内水分，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。（3）振动切片：用振动切片机，可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片2010m，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其适用于免疫电镜观察。（4）塑料切片：塑料包埋切片常用包埋剂有甲基丙烯酸盐类（GMA）及环氧树脂类（Epon 812，618），其优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片，光镜切片可薄至0.52m，故称半薄切片。GMA保存抗原较好，不与组织产生共聚合，但形态学结构欠佳。环氧树脂如Fpon和Araldite能较好地保存形态学结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时半薄切片进行免疫染色时，抗血清不易穿透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本，切片薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜阳性检出率。二、抗体的处理与保存抗体是免疫组织化学技术的首要试剂，目前国内外市场提供有多种特异性抗体，基本能满足工作的需要。如自制的异种抗血清，可用特异性抗原进行亲和层析，去除非特异性抗体，或将抗体稀释处理。三、免疫染色通常的程序是：标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；镜下观察结果。四、设立对照试验为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、自身对照和吸收试验等。第二节酶免疫组织化学技术免疫酶细胞化学是免疫细胞化学中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。一、酶标抗体法免疫酶标抗体技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机制和病理过程。基本原理：酶标抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。二、非标记抗体酶法由于酶标抗体存在一些缺点，例如：酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP法）。现分述如下。（一）酶桥法1.基本原理：首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节省第一抗体的用量。2.染色步骤酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故两者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。（二）PAP法1.PAP的特征：PAP复合物的形成不同于其他抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为ll.5s，分子量为400430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H202-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。2.PAP染色原理及步骤（1）原理：与酶桥法相似。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。（2）染色步骤：主要步骤与酶桥法相似。3.PAP法的评价：PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。三、酶标记亲和素-生物素技术方法基本原理：标记亲合素-生物素法（LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。桥连亲合素-生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。第三节荧光免疫组织化学技术荧光免疫组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons等（1950）建立，经过近43年的发展，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。它与亲合化学技术如葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机和扫描电视等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用使免疫荧光细胞化学技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。在免疫荧光细胞化学中应用单克隆抗体日益增多，将会不断提高特异性、敏感性和应用范围。由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性，在免疫学、微生物学、细胞和组织学、病理学、肿瘤学以及临床检验学等生物学和医学许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。免疫荧光组织化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。一、直接法1.检查抗原法：这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。2.检查抗体法将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。二、间接法1.检查抗体法（夹心法）：此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。2.检查抗体法：用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。3.检查抗原法双薄片：此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种属特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合35个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合35分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3至4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。三、补体法1.直接检查组织内免疫复合物法：用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物-抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处。此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。2.间接检查组织内抗原法：常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体-抗补体荧光抗体的复合物；此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。四、双标记荧光免疫法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。第四节免疫金（银）组织化学技术一、免疫胶体金特性1.胶体金特性：胶体金也称金溶胶，是由金盐被还原成金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl2-），外层离子层H+则分散在胶体金溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。蛋白质有保护胶体金稳定性作用。（1）胶体性质：胶体金具有胶体的多种特性，尤其是对电解质的敏感性（使其沉淀）。（2）呈色性：微小颗粒胶体呈红色，不同大小的胶体金呈色有一定差别，最小的胶金是橙黄色；中等大小的胶体金是酒红色；较大颗粒的胶体金呈紫红色。（3）光吸收性：胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长在510550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化（颗粒越小，波长越短）。2.免疫金的特性：用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，常称为免疫金复合物，简称免疫金。二、免疫金（银）染色1.免疫金（银）染色原理：在金免疫技术基础上发展起来的更为敏感的技术。利用金免疫技术测定的产物上的金颗粒可将银离子还原成银颗粒，在金颗粒表面形成一色泽更深的黑色层，因而增强了金免疫技术的敏感性。多用于组织化学检测。2.主要试剂：银染液。3.应用：金银染色提高了金免疫技术的敏感度，可替代荧光免疫技术以及以膜为载体的酶免疫法。金免疫技术的敏感度低于其他标记免疫技术，经银加强染色后敏感度可与荧光免疫技术和酶免疫技术相当。第五节免疫标记电镜技术一、免疫标记电镜技术的原理是利用电镜下可见的示踪标记物标记特异性抗体（或抗原），使之与组织超薄切片中的相应抗原（或抗体）反应，形成不溶性免疫复合物，用电镜观察可见的标记物，间接证实免疫反应的发生。二、常用的免疫标记电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术铁蛋白是一种含铁约占23%的蛋白质，分子量460kD，直径10-12m。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，铁胶粒直径核心为5560nm含20003000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。铁蛋白来自许多动物，以肝、脾含量较高，其中马脾脏含量最高。因而，商品铁蛋白主要是从马脾脏中提取的。（二）酶标记免疫电镜技术是以酶作为抗原抗体反应的标记物，在既不改变抗原抗体的免疫反应特异性也不影响酶活性的条件下，与相应的酶底物作用，形成一种不溶性的反应产物。在光学显微镜下观察时，要求反应的终末产物是不溶性的有色物质，具有可观察性。在电镜下观察时，则要求底物的终末产物具有较高的电子密度。由于辣根过氧化物酶具有稳定性强和反应特异性高等优点，是目前应用最多的酶标记物。实验方法包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶-抗过氧化物酶技术（即PAP法）。（三）胶体金标记免疫电镜技术标记金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清